Bitkisel Materyalin Temini
Araştırmada kullanılan bitkisel materyal D. osmanica türünün topraküstü kısımları 2014 yılında Mayıs ayında Gümüşhane’den kuru ağırlığı 100 g olacak şekilde toplandı. Bitkinin tür teşhisi Karadeniz Teknik Üniversitesi Eczacılık Fakültesi öğretim üyesi Prof. Dr. Ufuk Özgen tarafından yapıldı ve AEF-26708 herbaryum numarası ile Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (AEF) herbaryumunda saklandı. Bitki örneğimiz oda koşullarında ve gölgede kurutulduktan sonra analizde kullanılmak üzere renkli kavanozlarda muhafaza edildi.
Kullanılan Kimyasal Maddeler
Antioksidan, antimikrobiyal, tirozinaz inhibitör aktivite ve fenolik bileşenleri belirlemek için kullanılan kimyasallar analitik ya da HPLC sınıfı saflıkta olup Sigma-Aldrich (St. Louis, ABD) firmasından temin edildi.
Kullanılan Laboratuvar Cihazları
Bu çalışma yapılırken HPLC (Agilent 1100, DAD 1200 Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) cihazı, UV-VIS spektrofotometre (Spectro UV-VIS Double PC-8 auto cell, Labomed), rotary evaporator sistemi (IKA®, Werke, USA), çalkalayıcı (Heidolph Promax 2020), su banyosu (Nüve, ST 402), pH metre (Hanna pH 213, Romania), magnetik karıştırıcı (Hei-dolph MR 3001, Germany), bitki öğütme değirmeni (Retsch RM200, Germany) gibi laboratuvar cihazları kullanıldı.
Ekstraksiyon
Kurutulan topraküstü kısmı değirmen yardımıyla toz haline getirilip konsantrasyonu 10 mg/mL olacak şekilde metanol ile ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen D. osmanica bitkisi biyolojik aktivite tayinlerinde kullanılmak üzere 4 °C’de muhafaza edildi.
Toplam Fenolik Madde Miktarı Tayini
D. osmanica metanol ekstresinin toplam fenolik madde tayini kolorimetrik olarak yapıldı 21. Öncelikle, bitki özütünden (10 mg/mL) 50 μL ve farklı konsantrasyonlarda (31,25-62,5-125-250-500-1000 μg/mL) gallik asitten (standart) 50 μL deney tüplerine pipetleme yapıldı. Sonra her bir tüpe 2,5 mL saf su ve 250 μL Folin-Ciocalteu Reaktifi eklendi ve vortekslendi. 3 dk oda sıcaklığında bekletildikten sonra üzerine 750 μL %7,5’lik Na2CO3 ilave edilerek vortekslendi. Karışımlar oda sıcaklığında 2 saat bekletildi ve absorbans ölçümü 765 nm’de yapıldı. Toplam fenolik madde miktarı gram ya da mL numune başına μg olarak ifade edildi (μg Gallik asit eşdeğeri / gram kuru ekstrakt).
Demir İndirgeyici Antioksidan Güç (FRAP) Tayini
Benzie ve Szeto’nun metodu, Fe(III)-TPTZ (2,4,6-tripiridil-striazin) kompleksinin antioksidanlar varlığında indirgenerek mavi renkli kompleks Fe(II)-TPTZ’nin oluşması ve bu kompleksin 595 nm’de maksimum absorbans vermesi esasına dayanır 23. Bu amaçla, FRAP reaktifi [300 mM pH 3.6 asetat tamponu:10 mM TPTZ:20 mM FeCl3 (10:1:1)] taze hazırlandı, kullanılmaya başlayıncaya kadar düşük hızda karıştırıldı. 3 paralel olacak şekilde hazırlanan numune tüplerine ve numune körü tüplerine bitki ekstresinden 100 μL ve reaktif körü tüplerine numune çözücüsünden 100 μL pipetlendi. Numune tüplerine ve reaktif körü sıralarına 3.0 mL FRAP reaktifi, numune körü sırasına ise 3.0 mL FRAP çözücüsü (sumetanol (2:3)) 20 sn arayla pipetlendi ve vortekslendi. 20 dakika sonrasında tüplerin absorbansı 595 nm`de okundu. Standart olarak Troloks 5 farklı konsantrasyonda (1000- 500- 250-125-62.5 μM) hazırlandı ve aynı işlemlere tabi tutuldu.
2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Radikal Süpürme Kapasitesi Tayini
Molyneux metoduna göre, D. osmanica’nın metanol ekstresinin serbest radikali süpürme aktivitesini belir-lemek için 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikali kullanıldı 22. Bu metotta, ekstre aktivite gösterecek şekilde 5 farklı konsantrasyonda (100, 250, 500, 750 ve 1000 μg/mL) hazırlandı. DPPH çözeltisi ise 100 μM olacak şekilde metanolde çözülerek hazırlandı. Ardından tüpler kontrol tüpleri, numune tüpleri ve kör tüpleri olacak şekilde ayarlandı. Kontrol tüplerine ve numune tüplerine 750 μL numune konulup numune körü tüplerine numune yerine 750 μL numune çözücüsü ilave edildi. Numune pipetlemesi bitince 20 sn arayla önce kontrol tüplerine ardından numune tüplerine 750 μL DPPH çözeltisi ve en son numune körlerine 750 μL DPPH çözücüsü (metanol) pipetlendi ve vortekslendi. 50 dakika karanlık ortamda bekletildikten sonra 20 sn ara olacak şekilde 517 nm’de absorbans değerleri ölçüldü. Ölçüm sonrası elde edilen sonuçlar grafiğe geçirilip IC50 değerleri (mg/mL) hesaplandı. Bu çalışmada standart olarak bütillenmiş hidroksitoluen (BHT) kullanıldı ve BHT için aynı işlemler uygulandı.
Tirozinaz İnhibitör Aktivitesi Tayini
Bitki ekstresinin tirozinaz inhibisyon aktivitesi L-DOPA substratı ile dopakrom metoduna göre belirlendi 24. Mikroplakadaki kuyucuklara 25 μL örnek çözelti, 40 μL tirozinaz çözeltisi (mantar tirozinaz, 30 U, EC 1.14.1.8.1) ve 100 μL fosfat tamponu (pH 6.8) ilave edildi. Bu karışım 25 °C’de 15 dakika bekletildikten sonra 40 μL (10 mM) L-DOPA konuldu. Tirozinaz enzim çözeltisi olmadan hazırlanmış tepkime reaktiflerine örnek çözeltisi eklendi ve kör hazırlandı. Bitki ekstresinin ve körlerin absorbansları 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmesinin ardından 492 nm’de okundu. Gerçek absorbansları elde etmek adına körlerin absorbansları örneklerden çıkarıldı ve sonuç olarak IC50 değerleri hesaplandı.
HPLC Çalışmasında Standart Çözeltilerin Hazırlanması
Bu çalışmada, standart olarak gallik asit, protokate-kuik asit, protokatekuik aldehit, klorojenik asit, p-hidroksi benzoik asit, vanilik asit, kafeik asit, vanilin, şiringaldehit, ferulik asit, p-kumarik asit, sinapik asit, benzoik asit kullanılmıştır. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, standart karışımın stok çözeltisi, 5-100 μg/mL konsantrasyon aralığında seyreltildi.
HPLC Koşulları
Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, karışık standartların stok çözeltileri, 5-100 μg/mL konsantrasyonlarda seyreltildi. Fenolik bileşiklerin HPLC analizi [A: 100% metanol; B: su içinde 2% asetik asit (pH: 2,8)], bir HPLC sistemi (Shimadzu Corporation, LC 20AT, Kyoto, Japonya) üzerinde 1.5 mL/dk sabit bir çözücü akış oranında bir ters faz kolon kullanılarak gerçekleştirildi. Enjeksiyon hacmi 20 μL, sinyaller, 232 °C, 246 °C, 260 °C, 270 °C, 280 °C, 290 °C, 308 °C ve 328 °C'de, 25 °C kolon sıcaklığında DAD dedektörü ile kaydedildi.
HPLC Yöntemiyle Analizlerin Yapılması
HPLC analizinde ayırmalar bir ters faz kolonu olan LiChoCART RP-18 (12,5 cm x 0,4 cm, partikül büyüklüğü 5μm) ile yapıldı. 1 mL/dk akış hızında hareketli faz olarak suformik asit (19:1) (çözücü A) ve sabit faz olarak metanol (çözücü B) kullanıldı. Martos ve ark. (1997)’nın metoduna göre uygulanan çözücü gradientleri şöyledir: 30% metanol (B) ve çözücü A (gradient uygulanmayan çözücü) 15 dakika boyunca kolondan geçirildi, metanol gradienti dakikalar ilerledikçe oranı artırılarak 41. dakikaya kadar gradientte devam edildi 25. HPLC’ye enjekte edilen örnek ekstraktı için 290 nm ve 340 nm’de kromatogramlar incelendi. Fenolik asitlerin tanınması ve miktarının belirlenmesi için UV spektrumları ve alıkonma zamanları standartlarla karşılaştırıldı.
Antimikrobiyal Aktivite Tayini
Antimikrobiyal aktivite testleri agar kuyucuk difüzyon yöntemine göre çalışıldı (26). Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Mycobacterium smegmatis bakterileri ve Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae mantarları kullanıldı.
Agar Kuyucuk Difüzyon Metoduyla Antimikrobiyal Aktivitesinin Belirlenmesi
D. osmanica ekstresinin antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesinde ilk olarak agar kuyucuk difüzyon metodu kullanıldı. Bu çalışmada, Mueller Hinton agar ve sıvı besiyerleri bakteriler için, Brain heart infusion (BHI) sıvı ve katı besiyeri M. smegmatis için, maya ekstreli sıvı besiyeri (YEG) (Difco, Detriot, MI) mantarlar için ve Potato Dextrose agar (PDA) (Difco, Detriot, MI) kullanıldı. Test edilecek bakterilerin bir gecelik kültürlerinden, sıvı besiyeri içinde yaklaşık olarak 106 kob/mL (koloni oluşturan birim=colony forming unit) şeklinde dilüsyonlar hazır hale getirildi ve katı besiyerlerine yaygın ekimleri yapıldı. Sonrasında steril cam boru ile besiyerleri üzerinde 2 cm aralıklarda, 5 mm çapında kuyucuklar açıldı. Her bir kuyucuğa ekstrenin 1 mL’sinde hazırlanmış stok çözeltilerden 50 μL damlatıldı. İnkübasyon işlemi bakteriler için 24 saat, mayalar için 48 saat olacak şekilde 36 ºC’de petrilerde yapıldı. İnhibisyon zonları bir cetvel yardımı ile ölçüldü. Standard kontrol ilaç olarak ampisilin, flukonazol ve streptomycin kullanıldı.