Gereç ve Yöntem: Çalışmada, 21 adet Wistar albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları 3 eşit gruba ayrıldı. Kontrol grubuna deney süresi olan 21 gün boyunca hiçbir uygulama yapılmadı. Takrolimus grubuna takrolimus 0.8 mg/kg/gün, Takrolimus + vitamin D grubuna ise 0.8 mg/kg/gün takrolimus ile birlikte 50 IU/gün dozunda vitamin D deney süresi boyunca oral olarak verildi. Deney sonunda sıçanlar dekapite edildi ve beyin dokuları çıkarıldı. Rutin takip işlemleri ile dokular parafin bloklara gömüldü. Bloklardan alınan kesitlere bax immünreaktivitesi için avidin-biodin-peroksidaz yöntemi, Malondialdehit (MDA) düzeyi için spektrofotometri, apoptozis için TUNEL yöntemi kullanıldı.

Bulgular: Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında MDA düzeyleri, bax immünreaktivitesi ve TUNEL pozitifliğinde Takrolimus grubunda istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artış saptandı. Takrolimus grubu ile karşılaştırıldığında ise Takrolimus+Vit D grubunda, MDA düzeyleri, bax immünreak-tivitesi ve TUNEL pozitifliğinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma izlendi.

Sonuç: Bu çalışma takrolimusun beyin dokusunda apoptozisi indüklediğini ve D vitaminin takrolimusun etkilerine karşı koruyucu etkileri olabileceğini göstermiştir.

Takrolimus tedavisinin nörolojik komplikasyonları arasında yaygın olarak baş ağrısı, parestezi, tremor, uyku bozuklukları, fotofobi ve dizestezi gibi nisbeten hafif bulgular görülebilmekle birlikte daha nadir olarak konfüzyon, nöbet, posterior reversible ensefalopati sendromu (PRES), akinetik mutizm, dizartri, koma, afazi, parkinsonizm, ensefalopati ve intrakranial hemoraji gibi daha ciddi yan etkiler de görülebilmektedir ^3-7. Bu yan etkiler; takrolimusun insan beynindeki kal-sinörin immunreaktivitesini güçlü bir şekilde azaltması ile ^8, ayrıca beyin endotelindeki p-glikoprotein eksp-resyonunu azaltarak kan-beyin bariyerinin bozulması ve vazojenik ödem oluşması sonucunda gelişmektedir ⁹.

D vitamini; yağda eriyen vitaminler arasında yer al-maktadır. En önemli etkisi kalsiyum, fosfor metabolizması ve kemik mineralizasyonu üzerinedir ¹⁰. Son zamanlarda yapılan hayvan çalışmasında vitamin D’nin nöroprotektif fonksiyonunun olduğu gösterilmiştir ¹¹. Son yıllarda D vitamini eksikliği akut iskemik inme, nörogelişimsel bozukluklar ve zihinsel engeller, kardiyovasküler riskler ve mortalite gibi çeşitli hastalıklarda eşlik eden bir durum olarak dikkati çekmiştir ^12-14. Yapılan çalışmalarda steroid hormon olan D vitamininin kognitif süreçlerin modülasyonunda, nörotrofik sinyalizasyonda, nöroproteksiyonda ve inflamasyonda rol aldığı gösterilmiştir ^15-17.

Bu çalışmada sıçan beyin dokusunda takrolimusun meydana getirdiği değişiklikler üzerine, nöroprotektif etkinliği kanıtlanan vitamin D’nin iyileştirici etkilerinin histolojik ve immünohistokimyasal olarak incelenmesi amaçlanmıştır.

Malondialdehid (MDA) Çalışması
0.42 gr Tris-Base + 1.43 gr Tris-HCI + 3 gr KCI ve 0.5 ml Tween 20, 250 ml distile suda hazırlandı. Ha-zırlanan bu tampon örneklerin homojenatında kullanıldı. X gr doku üzerine 5 ml tampon ilave edildi ve parçalandı. Homojenat 5000 rpm de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatant kısımdan 1 ml başka bir tüpe alındı. Alınan 1ml örnek üzerine 1ml %10’luk Triklo-setik Asit (TCA) (10 gr TCA 100 ml distile suda hazırlandı ) ilave edildi. Üzerine 1ml %0.6 Tiyobarbiturik Asit (TBA) ilave edildi. Üzerine 1ml distile su ilave edildikten sonra, son olarak 0.5 ml %4 HCI ilave edildi.

Hazırlanan karışım 90-95º C de 120 dk inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası tüpler oda sıcaklığında soğutuldu ve üzerine 3 ml bütanol ilave edilip vortekslendi. Daha sonra tüpler 5 dk 5000 rpm de santrijüj edildi ve oluşan (bütanol faz) Süpernatanttaki kırmızı-pembe renk spekro küvetine pipet yardımıyla alındı ve bütanole karşı 532 nm de okundu. Okunan absorbans değeri x: (okunan ABS +0.0344)/0.0492 formülüyle hesaplandı. Bulunan değer doku homojenatı 5ml tamponda hazırlandı için 5 ile çarpıldı.

İmmünohistokimya
Parafin bloklardan 4-6 µm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Deparafinize edilen dokular dereceli alkol serilerinden geçirilip antigen retrieval için sitrat tampon solüsyonunda pH:6’da mikrodalga fırında (750W) 12 dakika kaynatıldı. Kaynatma sonrası oda ısısında yaklaşık 20 dakika soğutmak için bekletilen dokular PBS (Phosphate Buffered Saline, P4417, Sigma-Aldrich, USA) ile yıkandıktan sonra endojen peroksidaz aktivitesini önlemek için hidrojen peroksid blok solusyonu ile 5 dakika inkübe edildi (Hydrogen Peroxide Block , TA-125-HP, Lab Vision Corporation, USA). PBS ile yıkanan dokulara zemin boyasını engellemek için 5 dakika Ultra V Block (TA–125-UB, Lab Vision Corporation, USA) solüsyonu uygulandıktan sonra 1/200 oranında dilüe edilen primer antikor (Bax Mouse monoclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology sc–7480 California, USA) ile nemli ortamda oda ısısında 60 dakika inkübe edildi. Dokular, primer antikor uygulanmasından sonra PBS ile yıkandıktan sonra sekonder antikor (biotinylated Goat Anti-Poliyvalent (anti-mouse / rabbit IgG), TP–125-BN, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildi. Dokular, Sekonder antikor uygulanmasından sonra PBS ile yıkanıp Streptavidin Peroxidase (TS–125-HR, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildikten sonra PBS içerisine alındı. Dokulara 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate + AEC Chromogen (AEC Substrate, TA-015 ve HAS, AEC Chromogen, TA-002-HAC, Lab Vision Corporation, USA) solusyonu damlatılıp ışık mikroskobunda görüntü sinyali alındıktan sonra eş zamanlı olarak PBS ile yıkamaya alındı. Mayer’s hematoksilen ile zıt boyaması yapılan dokular PBS ve distile sudan geçirilerek uygun kapatma solusyonu (Large Volume Vision Mount, TA-125-UG, Lab Vision Corporation, USA) ile kapatıldı. Ha-zırlanan preparatlar Leica DM500 mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı (Leica DFC295).

Boyamada immünreaktivitenin yaygınlığı (0.1: <%25, 0.4: %26-50, 0.6: %51-75, 0.9: %76-100) ve şiddeti (0: yok, +0.5: çok az, +1: az, +2: orta, +3: şiddetli) esas alınarak histoskor oluşturuldu. Histoskor= yaygınlık x şiddet.

TUNEL Metodu
Parafin bloklardan 5-6 μm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Üretici firmanın talimatları doğrultusunda ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, cat no: S7101, USA) kullanılarak apoptoza giden hücreler belirlendi.

Xylene ile deparafinize edilen dokular, dereceli alkol serilerinden geçirilerek phosphate buffered saline (PBS) ile yıkandı. %0.05’lik proteinase K ile 10 dakika inkübe edilen dokular, endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için %3 hydrogen peroxide ile 5 dakika inkübe edildi. PBS ile dokular yıkandıktan sonra, 6 dakika Equilibration Buffer ile inkübe edilip, 37º C’ de nemli ortamda çalışma solüsyonu (%70 μl Reaction Buffer+%30 TdT Enzyme) ile 60 dakika inkübe edildi. Stop/Wash Buffer da 10 dakika bekletilen dokular, Anti-Digoxigenin-Perosidaz ile 30 dakika muamele edildi. Diaminobenzidine (DAB) substratı ile apoptotik hücreler görüntülendi. Harris hematoksilen ile zıt boyası yapılan kesitler uygun kapatma solüsyonu ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Leica DM500 mikrosko-bunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı (Leica DFC295). TUNEL boyamanın değerlendirilmesinde Harris hematoksilen ile maviye boyanmış çekirdekler normal, kahverengi nükleer boyanma gösteren hücreler apoptotik olarak değerlendirildi. Kesitlerde 10'luk büyütmede rastgele seçilen alanlarda, normal ve apoptotik en az 500 hücre sayıldı. Apoptotik hücrelerin, toplam (normal + apoptotik) hücrelere oranlanması ile Apoptotik indeks (AI)’i hesaplanarak istatistiksel analizleri yapıldı.

İstatistiksel Analiz
Çalışmada kullanılacak değişkenler için %80 güç ve 0.05 anlamlılık seviyesinde bir güç analizi yapıldığında her bir grupta en az 7 adet olgu olması gerektiği hesaplandı. Elde edilen veriler ortalama ± standart sapma olarak belirlendi. İstatistiksel analiz için SPSS version 22 programı kullanıldı. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Kolmogorov-Simirnov testi ile kontrol edilmidi. Gruplar arası değerlendirme One-way ANOVA ve posthoc tukey testi ile yapıldı, p <0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Kalsinörin inhibitörü olan takrolimus; transplant reddinin önlenmesi için önerilen tedavi kombinasyonlarının en önemli bileşenlerinden biridir ^18,19. Takrolimus, esas olarak interlökin 2 (IL-2) transkripsiyonunun inhibisyonuna neden olarak T lenfosit aktivasyonunu inhibe eder, bunun sonucu olarak immünsüpresif etkiyi sağlar ²⁰. Solid organ nakli olan alıcılarda immünosupresyon tedavi rejimlerinin temel taşını oluşturur ^21,22. Takrolimus tedavisi sonrası hastalarda baş ağrısı, parestezi, tremor, uyku bozuklukları, fotofobi, dizestezi, konfüzyon, nöbet, PRES, akinetik mutizm, dizartri, koma, afazi, parkinsonizm ve intrakranial hemoraji gibi nörolojik komplikasyonlar görülebilmektedir ^3,6,7.

D vitamininin majör fonksiyonu plazma kalsiyum seviyesini düzenlemektir ²³. Ayrıca hücre proliferasyonu, farklılaşması, immünoregülasyon ve benzeri hücre modülasyonunda vitamin D'nin önemli bir rol oynadığını gösteren kanıtlar mevcuttur ²⁴. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda bağışıklık sistemini düzenlemede D vitamininin de rolü olduğu belirlenmiştir ^25,26. D vitamininin ayrıca immünsüpresyona yardımcı olduğu gösterilmiştir ²⁷.

Gezen-Ak ve arkadaşının ²⁸ 2018’de yaptığı çalışmada öne sürdüğü teoride; D vitaminin yıllardır insan vücudunda kalsiyum homeostazının korunmasındaki rolü ile bilindiğini, dolayısyla D vitamininin, kemiklerde olduğu gibi, kalsiyum kullanan diğer organlardan biri olan beyinde de en azından bazı işlevlere sahip olması gerektiğini ifade edilmiştir. Bir nörosteroid olan D vitamininin “basit bir vitamin” olmadığı, Alzheimer hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklarda etkin rol aldığı saptanmıştır.

Bu çalışmada sıçan beyin dokusunda takrolimusun meydana getirdiği değişiklikler üzerine vitamin D’nin etkisi test edilmiştir. Çalışmamızda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında takrolimus verilen grupta beyin dokusunda MDA düzeyi, bax immünreaktivitesi ve TUNEL metodu ile bakılan apoptoz miktarında belirgin bir artış gözlendi. Takrolimus grubu ile karşılaştırıldığında D vitaminin tedavi olarak verildiği takrolimus + vitamin D grubunda MDA düzeyi, bax immünreaktivitesi ve TUNEL metodu ile bakılan apoptoz miktarında anlamlı azalma izlendi. Bu da takrolimus kullanımı ile beyin dokusunda oluşabilecek olumsuz etkilere karşı D vitamininin koruyucu etkisinin olabileceğini düşündürmektedir. Vitamin D’nin bu koruyucu etkisi muhtemelen antiinflamatuar etkinliği ve kan-beyin bariyerinin bozulmasını engellemesi sonucunda ortaya çıkmaktadır.

Sutherland ve arkadaşları ²⁹ 1992'de Alzheimer hastalığında D vitamini reseptörünün (VDR) potansiyel rolünü gösteren ilk çalışmayı yapmıştır ve Alzheimer hastalarının hipokampal CA1 ve CA2 nöronlarında vitamin D reseptörü mRNA seviyelerinin azaldığını göstermiştir. 2013 yılında yapılan bir çalışmada böbrek nakli yapılanlarda kullanılan takrolimusun dozdan bağımsız olarak D vitamini eksikliğine sebep olduğu bulunmuştur. Aynı çalışmada D vitamini eksikliği ile böbrek yetmezliği arasında bir ilişki bulunmamıştır ³⁰. Bu da takrolimusun böbrek yetmezliğinden bağımsız olarak D vitamini eksikliğine neden olduğunu göstermektedir.

Takrolimus ve vitamin D tedavisinde takrolimus tekli tedavisine kıyasla daha az enflamatuar hücre infiltrasyonu görülmüştür ²⁷. Takrolimus ile immünsupresyon yapılan böbrek transplantlı hastalarda D vitamininin Th17 immün yanıtı üzerinde baskılayıcı bir etkisi olduğunu gösterilmiştir. Hatta takrolimus alan hastalarda immünsüpresyon rejimlerinin etkinliğini artırmak için D vitamininin rutin olarak kullanılmasını önerilmiştir ³¹. Ayrıca, 2018 yılında yapılan bir çalışmada, uygulanmasının kolay olması, invaziv olmaması ve ucuz olmasından dolayı, inme ve merkezi sinir sisteminin diğer enflamatuar ve dejeneratif hastalıklarının tedavisinde D vitamini takviyesinin faydalı ve uygulanabilir olduğu sonucuna ulaşılmıştır ³².

Sonuç olarak, bu çalışmada D vitamininin takrolimus alan ratların beyin dokusunda apoptozise gidişi, MDA düzeylerini ve bax immünreaktivitesini azalttığı gözlenmiş olup gelecekte daha ileri ve kapsamlı çalışmalarla D vitamininin takrolimus gibi immünsüpresan tedavilere bağlı meydana gelen toksik etkilerinin azaltılmasında bir tedavi seçeneği olarak kullanılabileceğini düşünmekteyiz.

1) Miyata S, Ohkubo Y, Mutoh S. A review of the action of tacrolimus (FK506) on experimental mo-dels of rheumatoid arthritis. Inflamm Res 2005; 54: 1-9.

2) Barraclough KA, Isbel NM, Johnson DW, Camp-bell SB, Staatz CE. Once- versus twice-daily tacrolimus: are the formulations truly equivalent? Drugs 2011; 71: 1561-77.

3) Bersani G, Marino P, Valeriani G, et al. Manic-like psychosis associated with elevated trough tacrolimus blood concentrations 17 years after kidney transplant. Case Rep Psychiatry 2013; 2013: 926395-7.

4) Senzolo M, Marco S, Ferronato C, Cecilia F, Burra P, Patrizia B. Neurologic complications after solid organ transplantation. Transpl Int 2009; 22: 269-78.

5) Pustavoitau A, Bhardwaj A, Stevens R. Neurological complications of transplantation. J Intensive Care Med 2011; 26: 209-22.

6) Teotónio R, Marmoto D, Januário C, Bento C. Posterior reversible encephalopathy syndrome: the importance of early diagnosis. BMJ Case Rep 2012; 2012. pii: bcr2012006852.

7) Gmitterová K, Minár M, Žigrai M, Košutzká Z, Kušnírová A, Valkovič P. Tacrolimus-induced parkinsonism in a patient after liver transplantation - case report. BMC Neurol 2018; 18: 44-7.

8) Wada A, Kunii Y, Matsumoto J, et al. Decreased calcineurin immunoreactivity in the postmortem brain of a patient with schizophrenia who had been prescribed the calcineurin inhibitor, tacrolimus, for leukemia. Neuropsychiatr Dis Treat 2016; 12: 1645-50.

9) Wijdicks EF. Neurotoxicity of immunosuppressive drugs. Liver Transpl 2001; 7: 937-42.

10) Champe PC, Harvey RA, Ferrier DR. Biyokimya. Çeviri Editörü: Ulukaya E. Lippincott’s Illustrated Reviews Serisinden 3. Baskı. Nobel Tıp Kitapevleri; 2007.

11) Calvello R, Cianciulli A, Nicolardi G, et al. Vitamin D treatment attenuates neuroinflammation and dopaminergic neurodegeneration in an animal mo-del of parkinson's disease, shifting M1 to M2 microglia responses. J Neuroimmune Pharmacol 2017; 12: 327-39.

12) Alfieri DF, Lehmann MF, Oliveira SR, et al. Vitamin D deficiency is associated with acute ischemic stroke, C-reactive protein, and short-term out-come. Metab Brain Dis 2017; 32: 493-502.

13) Grant WB, Wimalawansa SJ, Holick MF, et al. Emphasizing the health benefits of vitamin D for those with neurodevelopmental disorders and intel-lectual disabilities. Nutrients 2015; 7: 1538-64.

14) Matyjaszek-Matuszek B, Lenart-Lipińska M, Woźniakowska E. Clinical implications of vitamin D deficiency. Prz Menopauzalny 2015; 14: 75-81.

15) Dicou E. Neurotrophins and neuronal migration in the developing rodent brain. Brain Res Rev 2009; 60: 408-17.

16) Kalueff AV, Tuohimaa P. Neurosteroid hormone vitamin D and its utility in clinical nutrition. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007; 10: 12-9.

17) Bellia A, Garcovich C, D'Adamo M, et al. Serum 25-hydroxyvitamin D levels are inversely associa-ted with systemic inflammation in severe obese subjects. Intern Emerg Med 2013; 8: 33-40.

18) Baker R, Jardine A, Andrews P. renal association clinical practice guideline on post-operative care of the kidney transplant recipient. Nephron Clin Pract 2011; 118: 311-47.

19) Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Transplant Work Group. KDIGO clinical practice guideline for the care of kidney transp-lant recipients. Am J Transplant 2009; 9: 1-155.

20) Sehgal VN, Srivastava G, Dogra S. Tacrolimus in dermatology-pharmacokinetics, mechanism of action, drug interactions, dosages, and side effects: part I. Skinmed 2008; 7: 27-30.

21) Jouve T, Rostaing L, Malvezzi P. New formulations of tacrolimus and prevention of acute and chronic rejections in adult kidney-transplant recipients. Expert Opin Drug Saf 2017; 16: 845-55.

22) Guarino M, Benito-Leon J, Decruyenaere J, et al. EFNS guidelines on management of neurological problems in liver transplantation. Eur J Neurol 2006; 13: 2-9.

23) Öngen B, Kabaroğlu C, Parıldar Z. D vitamini’nin biyokimyasal ve laboratuvar değerlendirmesi. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2008; 6: 23-31.

24) Samuel S, Sitrin MD. Vitamin D’s role in cell proliferation and differentiation. Nutr Rev 2008; 66: 116-24.

25) Hesketh CC, Knoll GA, Molnar AO, Tsampalieros A, Zimmerman DL. Vitamin D and kidney transplant outcomes: a protocol for a systematic review and meta-analysis. Syst Rev 2014; 3: 64.

26) Pludowski P, Holick MF, Pilz S, et al. Vitamin D effects on musculoskeletal health, immunity, auto-immunity, cardiovascular disease, cancer, fertility, pregnancy, dementia and mortality-a review of re-cent evidence. Autoimmun Rev 2013; 12: 976-89.

27) Yuan D, Fang Z, Sun F, et al. Effect of vitamin D and tacrolimus combination therapy on IgA neph-ropathy. Med Sci Monit 2017; 23: 3170-7.

28) Gezen-Ak D, Dursun E. Molecular basis of vitamin D action in neurodegeneration: the story of a team perspective. Hormones (Athens) 2018; 27: 1-5.

29) Sutherland MK, Somerville MJ, Yoong LK, Ber-geron C, Haussler MR, McLachlan DR. Reduction of vitamin D hormone receptor mRNA levels in Alzheimer as compared to Huntington hippocampus: correlation with calbindin-28k mRNA levels. Brain Res Mol Brain Res 1992; 13: 239-50.

30) Eyal O, Aharon M, Safadi R, Elhalel MD. Serum vitamin D levels in kidney transplant recipients: the importance of an immunosuppression regimen and sun exposure. Isr Med Assoc J 2013; 15: 628-33.

31) Chung BH, Kim BM, Doh KC, et al. Suppressive effect of 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 on Th17-immune responses in kidney transplant recipients with tacrolimus-based immunosuppression. Transplantation 2017; 101: 1711-9.

32) Sayeed I, Turan N, Stein DG, Wali B. Vitamin D deficiency increases blood-brain barrier dysfunction after ischemic stroke in male rats. Exp Neurol 2018; 312: 63-71.