Gereç ve Yöntem: Sıçanlar, kontrol, demir ve demir+vitamin E grupları olmak üzere üç gruba ayrıldı. Demir ve demir+vitamin E gruplarındaki sıçanlara intraserebroventriküler olarak demir (FeCl₃6H₂O, 200 mM, 2.5 μl) verildi. Demir+vitamin E grubundaki sıçanlara operasyonu takiben on gün süreyle 100 mg/kg/gün dozunda vitamin E intraperitoneal olarak verildi. Onuncu günün sonunda, bütün gruplardaki hayvanlar intrakardiyak yolla perfüze edildikten sonra dekapite edildiler. Beyin dokuları çıkarılarak standart histolojik doku takibi uygulandı. Toplam Purkinje hücre sayıları tarafsız sayım metodu olan stereolojik yöntemle hesaplandı.

Bulgular: Ortalama toplam Purkinje hücre sayıları, kontrol grubunda 490584±13286; demir grubunda 331497±10764 ve demir+vitamin E grubunda 412118±15842 olarak bulundu. Demir ve demir+vitamin E grupları karşılaştırıldığında, vitamin E'nin demirin indüklediği Purkinje hücre kaybını %32.4'den %15.9'a düşürdüğü bulundu (p<0.01).

Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları, vitamin E'nin sıçan serebellumunda demirin indüklediği Purkinje hücre kaybını dikkate değer ölçüde geri çevirdiğini gösterdi. Bu nöroprotektif etkinin, vitamin E'nin serbest radikaller üzerine antioksidan aktivitesinden kaynaklandığı düşünülmektedir.

Hücrede meydana gelen çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşan serbest radikallerin olumsuz etkilerine karşı antioksidanlar tarafından hücre korunmaktadır. Antioksidan sistem, serbest radikallerin etkilerini farklı basamaklarda önlemeye, sınırlamaya veya kısmen tamir etmeye çalışır⁹. Bu antioksidan moleküllerin en önemlilerinden birisi de yağda eriyip hücre zarında kolaylıkla geçiş yapabilen vitamin E'dir (α-tokoferol). Hücre membranlarının bütünlüğünün korunması vitamin E'in en önemli fonksiyonlarından birisidir. E vitamini (α-tokoferol) serbest oksijen radikallerinin oluşmasına neden olan lipid peroksidasyon reaksiyonunun ilerlemesini önleyen major zincir kırıcı bir antioksidandır^10,11. Bununla birlikte, α-tokoferol non-enzimatik ve hızlı antioksidan reaksiyonlar oluşturur ve eğer serbest oksijen radikalleri oluşmuş ise onları da nötralize eden en güçlü anti-oksidanlardan biridir^12,13. Eksikliğinde hücrelerin peroksitlere karşı duyarlılığı artar ve anormal hücre membranları oluşur, alyuvarlarda yaşam süresi kısalır. E vitamini sevisindeki düşüklüğün spinoserebellar dejenerasyona da sebep olduğu belirtilmiştir¹⁴. Ayrıca, penisilin ile deneysel epilepsi oluşturulan sıçanlarda vitamin E epileptik aktivitenin frekansını azaltarak antiepileptik etki göstermiştir¹⁵.

Serebellum, periferdeki çeşitli reseptörlerden beyine gelen bilgi ile beynin bu bilgilere karşı oluşturduğu cevapları karşılaştırarak hareketlerin düzenlenmesinden sorumludur. Bu fonksiyonu yerine getiren serebellum korteksinin tek çıkışı Purkinje hücreleridir. Dolaysıyla, serebellumun fonksiyonlarında Purkinje hücrelerinin çok önemli bir yeri olmakla birlikte bu hücreler alkol toksisitesi ve iskemi gibi çeşitli patolojik durumlara da oldukça duyarlıdırlar^16,17. Ayrıca, daha önce yapmış olduğumuz bir çalışmada da, intraserebroventriküler olarak verilen demirin, sıçan serebellar Purkinje hücrelerinde nörotoksisite oluşturduğu gösterildi⁵. Sunulan çalışmada, intraserebroventriküler olarak verilen demirin, sıçan serebellar Purkinje hücrelerinde oluşturduğu nörotoksisiteye karşı hücre membranlarının korunmasında güçlü bir antiokidan olan vitamin E'nin nöroprotektif etkisinin olup olmadığını araştırıldı.

Operasyon ve Histolojik Prosedürler
Operasyondan 12 saat önce aç bırakılan sıçanlarda operasyonun hemen öncesinde, ketamin (100mg/kg) ve ksilasin 10 mg/kg intraperitoneal (i.p.) olarak yapılan injeksiyon ile anestezi oluşturuldu. Sıçanlar steriotaksik cihaza sabitlendikten sonra kafa derileri elektrikli koter ile (Ellman Surgitron) orta hattan rostro-kaudal yönde 2cm kesilerek açıldı. Kafa kemiği üzerinde bulunan tendon ve fasyalar uzaklaştırıldıktan sonra, Bregma net olarak görüldü. Sol lateral ventriküle uygun olacak şekilde Bregmanın 2mm lateralinde 0.6mm posteriyoründe 1mm çapında bir delik açıldı (18). Buradan 4.2mm derinliğe kadar Hamilton mikroenjektörü ile 0.5µl/dk hızında 2,5µl, 200mM'lık FeCl₃ çözeltisi, demir ve demir+E vitamini grubundaki sıçanlara intraserebroventriküler (i.c.v.) olarak verildi¹⁹. Kontrol grubundaki sıçanlara ise aynı hacimde serum fizyolojik, i.c.v. olarak verildi. Enjeksiyonu takiben insizyon yeri dikilerek 10% povidon iyot ile temizlendi ve hayvanlar kafeslerine yerleştirildi. Operasayondan sonra sıçanlar 10 gün süreyle yaşatıldı. Bu süre boyunca demir+E vitamini grubundaki hayvanlara 100mg/kg/gün dozunda E vitamini i.p. olarak verildi²⁰. Kontrol ve demir grubundaki sıçanlara ise aynı hacimde serum fizyolojik i.p. olarak verildi. On günlük sürenin sonunda, hayvanlar derin üretan anestezisi altında %10'luk formaldehid ve salin ile intrakardiyak yolla perfüze edildi. Perfüzyon tamamlandıktan sonra beyin dokuları çıkartılarak, beyin korteksi ve serebellum bir birinden ayırtıldı ve serebellumlar standart histolojik doku takibi uygulandıktan sonra paraplast bloklara gömüldü. Mikrotom ile (Leica RM 2135), horizontal planda, bloklardan 40µm'lik kesitler alınarak kresil violet ile boyandı.

Kesit örnekleme ve stereolojik analiz
Daha önceki yapılan çalışmalar da kullanılarak Purkinje hücre tabakasının hücresel yapı özellikleri belirlendi^5,21. Sistematik olarak yapılan örneklemede (ssf:1/7) her yedi kesitten bir tanesi alındı ve bu şekilde her hayvandan ortalama 14-16 cerebellum kesiti elde edildi. Serebellumdaki toplam Purkinje hücre sayıları ve analizleri bilgisayar destekli stereolojik görüntü analiz cihazında optik parçalama metodu kullanılarak hesaplandı¹². Hücre sayım alanlarının belirlenmesi ve sınırlarının çizilmesi CAST Grid stereolojik analiz yazılımı (Olympus, Denmark) kullanılarak yapıldı. Her bir kesitteki hücre sayıları yaklaşık 500 hücre sayacak şekilde örnekleme yapılarak elde edildi. Randomize olarak seçilen serebellum kesitinde x-y basamaklarında 200*200μm adımlarla örnekleme yapıldı ve bu seçilen alanlar 100x'lük objektifde optik disektör probuda kullanılarak analiz edildi. Optik disektör sayımında tarafsız olarak ayarlanmış olan %20'lik sayım çerçevesi kullanıldı. Böylece, örnekleme yapılan alanının fraksiyonu (asf) 587/40.000μm² olarak hesaplandı⁵.

Optik parçalama metodunun son basamağında ise örnekleme yapılan yerin kesit kalınlığı belirlenmektedir. Kesitin üst kısmında 5μm üst güvenlik zonu bırakıldıktan sonra 10μm'lik disektör yüksekliği ayarlanan bölgede sayım yapılmaktadır. Bütün bu tip ölçümler stereoloji sistemine uyumu sağlanmış dijital bir mikrokator (Heidenhain, Germany) ile yapıldı. Bundan dolayı, en son örnekleme basamağı genellikle kalınlık örnekleme fraksiyonu olarak (tsf) olarak adlandırılır ve [Disektör yüksekliğ]/[ortalama kesit kalınlığı] ile hesaplanır. Toplam kesitlerin ortalama kalınlığı 28.25±2.06μm olarak hesaplandı. Bütün kesitlerdeki örneklemeler tamamlandıktan sonra örneklenen Purkinje hücreleri disektör partikülleri (Q-) olarak hesaplandı. Toplam Purkinje hücre sayısı (N) olarak kabul edilerek aşağıdaki formül ile hesaplandı; N=[1/ssf]^*[1/asf]^*[1/tsf]×ΣQ-

Elde edilen veriler Statistical Package for Social Sciences (SPSS) v12.0 yazılımı kullanılarak istatistiksel açıdan değerlendirildi. Toplam ortalama Purkinje hücre sayısının analizi için post hoc Tukey testi kullanıldı. Grafik ve metin içerisinde kullanılan deney gruplarına ait değerler ortalama ± standart hata (SEM) olarak ifade edildi. Testlerden elde edilen sonuçlara göre p değeri 0.05'in altında olan farklılıklar anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Serebellumdaki Purkinje hücrelerinin mikrofotoğrafları: (A) Kontrol, (B) demir ve (C) demir+vitamin E grubu. Fotoğraf A'nın üzerinde serebellumun hücre tabakaları gösterilmektedir (GL: granüler tabaka, PL: Purkinje tabakası, ML: moleküler tabaka). Fotoğraflardaki oklar Purkinje hücrelerini göstermekte olup, C'deki bar 40 µm'yi ifade etmektedir.

Kontrol, demir ve demir+E vitamini gruplarına ait serebelumdaki ortalama toplam Purkinje hücre sayılarındaki yüzde değişim Şekil 2'de gösterilmiştir. Demir grubu, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, serebellumdaki Purkinje hücre sayısının %32.4 oranında azaldığı tespit edildi (p<0.001), (Şekil 2). Demir+vitamin E grubu, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Purkinje hücre sayısındaki azalmanın %15.9 oranında olduğu bulundu (p<0.05) (Şekil 2). Demir grubuyla demir+E vitamini grubu karşılaştırıldığında ise vitamin E'nin demirin neden olduğu hücre kaybını %32.4'den %15.9'a indirdiği ve serebelumdaki Purkinje hücrelerini demirin toksik etkisinden koruduğu anlaşıldı. (p<0.01), (Şekil 2). Elde edilen bu bulgular, vitamin E'nin demirin serebellumda oluşturduğu toksik hasarı azaltabileceğini göstermektedir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Serebellumdaki toplam Purkinje hücre sayılarındaki yüzde değişim (n=10). Kontrol grubuna göre,* p<0.001 ve p<0.05; demir+vitamin E grubuna göre p<0.01. Bütün sonuçlarda ortalama ±SEM değerleri kullanıldı.

Demir normal beyin fonksiyonlarının korunmasında önemli bir rol oynar. Ancak demir birikimi veya hidroksil radikal yapılarının artması bazı nörodejeneratif hastalıkların yıkıcı etkileriyle yakından ilgilidir²³. Demir, lipid peroksidayonu ve hücresel hasarı indüklemek için yaygın olarak kullanılan bir metaldir. Ferro (Fe²⁺) ve ferrik (Fe³⁺) demir Fenton ve Haber-Weis reaksiyonları ile hidroksil radikallerini oluşturur ve hücre hasarına neden olur²⁴. Sunulan çalışmada, oksidatif stresi indüklemek için beyin demir miktarı deneysel olarak artırıldı. Demirin i.c.v. olarak injeksiyonu sonucu sağ ve sol hipokampus demir konsantrasyonlarının birbirinden farklı olmadığı bununda muhtemelen demir moleküllerinin bütün beyin bölgelerine eşit oranda dağılmasından kaynaklandığı belirtilmiştir²⁵.

Ayrıca demir epileptik aktiviteyi indüklemek için de kullanılan bir maddedir. Meyerhoff ve ark.²⁶ sıçanlarda deneysel olarak epilepsi oluşturmak için demir klorürü 10µl hacim içinde 600mM konsantrasyonda intrakortikal olarak injekte etmişlerdir. Bizim çalışmamızda, demir injeksiyonu sonunda 10 günlük postoperatif dönemde sıçanlarda her hangi bir epileptik davranış gözlenmedi. Bu çalışmada 2.5µl hacim içinde 200mM demir klorür (i.c.v.) injekte edildi. Bu dozun epileptik aktivitenin tetiklenmesi için yeterli olmadığı daha önceki çalışmalarda da belirtilmiştir²⁵. Demir tuzlarının suda çözünmüş solüsyonlarının subpial injeksiyonunun da sıçanlarda serbest radikal oluşumuna neden olduğu bildirilmiştir¹⁹.

Merkezi sinir sistemi, yapısında bulunan endojen ve eksojen antioksidan sistemlerin diğer dokulara göre daha zayıf olmasından dolayı serbest radikallerin indüklediği oksidatif strese karşı daha fazla duyarlıdır²⁷. Ayrıca, beyin dokusu demirin indüklediği serbest radikal oluşmasına kolaylıkla katılabilen oldukça fazla miktarda poliansature yağ asidi içermektedir. Bizim çalışmamızdaki veriler, serbest haldeki demir klorür injeksiyonunun Purkinje hücre sayısında azalmaya neden olduğunu ve eksojen olarak uygulanan vitamin E'nin bu hasarı anlamlı olarak azalttığını göstermektedir. Bizim çalışmamızla oldukça yakından ilgili olarak, Heaton ve ark.²⁸ neonatal ve postnatal dönemde yüksek doz etanole maruz kalan ratlardaki serebellar Purkinje hücre kaybına karşı vitamin E'nin koruyucu etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, sıçan hipokampal nöron kültüründe β-amiloidin induklediği toksisite ve cerebellar granüler hücre kültüründe glutamatın induklediği sitotoksisitenin α-tokoferol tarafından önlendiği bildirilmiştir^29,30

Eksojen bir antioksidan olan vitamin E, bu etkilerini esas olarak lipit peroksidasyon zincirinin ilerlemesini engelleyerek göstermektedir³¹. Farklı konsantrasyonlarda kronik etanol alan sıçanların beyin sapı lipit peroksidasyonunu gösteren TBARS seviyelerinde artma, antioksidan sistemin bir göstergesi olan glutatyon (GSH) seviyelerinde ise azalma olduğu bulunmuştur²⁰. Aynı çalışmada, vitamin E'nin (100mg/kg/gün, i.p.) etanolün oluşturduğu bu toksik etkileri anlamlı olarak azalttığı tespit edilmiştir²⁰. Ayrıca, mitokondri, endoplazmik retikulum ve hücre zarlarının fosfolipitleri α-tokoferole afinite gösterir ve vitamin bu noktalarda yoğunlaşır. Bundan dolayı mikrozomal membranlardaki vitamin E miktarı perokside edici ajanların oluşturduğu hasara karşı korunma kapasitesinin belirlenmesinde katkı sağlar³². Bütün bu veriler dikkate alındığında, vitamin E'nin Purkinje hücrelerini koruyucu etkisinin en muhtemel mekanizmasının, vitamin E'nin antioksidan özelliği ile demirin neden olduğu hücre hasarını azaltması olduğu düşünülmektedir.

Sonuç olarak, sıçanlara i.c.v. olarak verilen demir klorür'ün (FeCl₃), serebellumdaki Purkinje hücrelerinin ölümüne neden olduğu ve vitamin E'nin Purkinje hücrelerini, demirin zararlı etkilerinden koruduğu tarafsız bir sayım metodu olan stereolojik yöntem ile ilk defa bu çalışmada gösterilmiştir.

TEŞEKKÜR
Bu çalışma Ondokuz Mayıs Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Destek Fonu tarafından desteklenmiştir.

1) Aisen P, Enns C, Wessling-Resnick M. Chemistry and biology of eukaryotic iron metabolism. Int J Biochem Cell Biol 2001; 33: 940-959.

2) Hill JM, Switzer RC. The regional distribution and cellular localization of iron in the rat brain. Neuroscience 1984;11:595-603

3) Qian ZM, Wang Q. Expression of iron transport proteins and excessive iron accumulation of iron in the brain in neurodegenerative disorders. Brain Res. Rev. 1998; 27:257-267.

4) Bostanci MO, Bağırıcı F. Nitric oxide synthesis inhibition attenuates iron-induced neurotoxicity: A stereological study. Neurotoxicology 2008a; 29: 130-135.

5) Kozan R, Bostancı MÖ, Sefil F ve ark. Sıçan Serebellumunda Demirin İndüklediği Purkinje Hücre Kaybına Nikardipinin Ko-ruyucu Etkisi: Stereolojik Bir Çalışma. Fırat Tıp Dergisi 2008; 13: 167-170.

6) Youdim MB, Ben-Shachar D, Riederer P. The role of monoamine oxidase, iron-melanin interaction, and intracellular calcium in Parkinson\'s disease. J Neural Transm Suppl. 1990; 32: 239-248.

7) Pu YM, Wang Q, Qian ZM. Effect of iron and lipid peroxidation on development of cerebellar granule cells in vitro. Neuroscience. 1999; 89: 855-861.

8) Thompson KJ, Shoham S, Connor JR. Iron and neurodegenerative disorders. Brain Res Bull 2001; 15:155-164.

9) Willcox JK, Ash SL, Catignani GL. Antioxidants and prevention of chronic disease Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2004; 44: 275-295.

10) Pryor WA: Free radicals in autoxidation and in aging. Ed. Armstrong D, Sohal RS, Cutler RG, Slater TF, NY Raven Press, New York 1984; 13-41.

11) Esterbauer H, Schmidt R, Hayn M. Relationships among oxidation of low-density lipoprotein, antioxidant protection, and atherosclerosis. Adv Pharmacol 1997; 38: 425-456.

12) Frei B. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: mechanisms of action. The Am J Med 1994; 26:5-13.

13) Hensley K, Benaksas EJ, Bolli R, et al. New perspectives on vitamin E: sgamma-tocopherol and carboxyelthylhyd roxychro-man metabolites in biology and medicine. Free Radic Biol Med 2004; 36:1-15.

14) Cellini E, Piacentini S, Nacmias B, et al. A family with spinocerebellar ataxia type 8 expansion and vitamin E deficiency ataxia. Arch Neurol 2002; 59:1952-1953.

15) Kozan R, Ayyildiz M, Yildirim M, et al. The influence of ethanol intake and its withdrawal on the anticonvulsant effect of α-tocopherol in the penicilin induced epileptiform activity in rats. Neurotoxicology 2007; 28: 463-470.

16) Bonthius DJ, Bonthius NE, Napper RM, et al. Purkinje cell deficits in nonhuman primates following weekly exposure to ethanol during gestation. Teratology 1996; 53: 230-236.

17) Welsh JP, Yuen G, Placantonakis DG, et al. Why do Purkinje cells die so easily after global brain ischemia? Aldolase C, EAAT4, and the cerebellar contribution to posthypoxic myoclonus. Adv Neurol 2002; 89: 331-359.

18) Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 4th Ed. Academic Press. Inc., CA, USA. 1998.

19) Willmore LJ, Hiramatsu M, Kochi H et al. Formation of superoxide radicals after FeCl3 injection into rat isocortex. Brain Res 1983; 277: 393-396.

20) Ağar E, Boşnak M, Amanvermez R, et al. The effects of ethanol on lipid peroxidation and glutathione level in the brain stem of rat. NeuroReport 1999; 10: 1799-1801.

21) Gundersen HJ (). Stereology of arbitrary particles. A review of unbiased number and size estimator and the presentation of some new ones, in memory of William R. Thompson. J. Microsc 1986; 143: 3-45.

22) Schmitz C, Hof PR. Design-based stereology in neuroscience, Neuroscience 2005; 130: 813-831.

23) Moos T. Brain iron homeostasis. Dan Med Bull 2002; 49:279-301.

24) Braughler JM, Duncan LA, Chase RL. The involvement of iron in lipid peroxidation, J Biol Chem 1986; 261: 10282-10289.

25) Bostanci MO, Bagirici F. Neuroprotective effect of aminoguanidine on iron-induced neurotoxicity. Brain Res Bull 2008b; 76: 57-62.

26) Meyerhoff JL, Lee JK, Rittase BW, et al. Lipoic acid pretreatment attenuates ferric chloride-induced seizures in the rat. Brain Res 2004; 1016:139-144.

27) Floyd RA, Hensley K. Oxidative stress in brain aging. Implications for therapeutics of neurodegenerativediseases. Neurobiol Aging 2002; 23:795-807.

28) Heaton MB, Mitchell JJ, Paiva M. Amelioration of ethanol-induced neurotoxicity in the neonatal rat central nervous system by antioxidant therapy. Alcohol Clin Exp Res 2000; 24:512-518.

29) Goodman Y, Mattson MP. Secreted forms of β-amyloid precursor protein protect hippocampal neurons against amyloid β-peptide-induced oxidative injury. Exp Neurol 1994; 128: 1-12.

30) Ciani E, Groneng L, Voltattorni M, et al. Inhibition of free radical production or free radical scavenging protects from the excito-toxic cell death mediated by glutamate in cultures of cerebellar granule neurons. Brain Res 1996; 728: 1-6.

31) Stocker R and Frei B. Endogenous Antioxidant Defenses in Human Blood Plasma. In: Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants, H. Sies, ed. Academic Press, Orlando, FL, 1991; 213-243.

32) Leibler PC. The rol of methabolism in the antioxidant function of vitamin E. Crit Rev Toxicol 1993; 23:147-169.