Serbest oksijen radikalleri ve reaktif oksijen türevi (ROT) bileşikler; hücrelerde dopamin ve adrenalin oksidasyonu, pürin katabolizması, aerobik metabolizma gibi normal kimyasal reaksiyonlar sırasında üretilen oldukça toksik bileşiklerdir ¹. Ayrıca radyasyon, sigara gibi çevresel faktörler ve hiperglisemi gibi normal metabolizmada gözlenen bazı değişiklikler de ROT bileşik sentezinde artışa neden olmaktadır ^2,3. Bu reaktif bileşikler yapısal özellikleri nedeni ile lipid, protein ve nükleik asit gibi hücre bileşenlerini okside etme kapasitesine sahiptir.

Bu bileşenlerin okside olması yapılarında değişikliklere neden olur. Bu da hücre fonksiyonlarının bozulması ve hücre ölümüne kadar giden bir süreci başlatır ⁴. ROT bileşiklerinin neden olduğu oksidan stresin diyabet, kanser gibi bir çok hastalığın patogenezinde ve komplikasyonlarının gelişmesinde önemli rol oynadığı kabul edilmektedir ^5,6.

ROT bileşiklerin zararlı etkilerinden korunmak için hücreler enzimatik ve nonenzimatik antioksidan savunma sistemlerini kullanırlar. Antioksidan bileşenlerin bazıları hücre tarafından sentez edilirken, bazıları da diyetle alınmaktadır. Gıdalarda bulunan α -tokoferol, keratenoitler ve C vitamini diyetle alınan önemli nonenzimatik antioksidan bileşiklerdir ⁷. Yağda eriyen vitaminlerden olan α-tokoferol, biyolojik sistemlerde önemli bir antioksidandır. Biyolojik membranların lipid tabakaları arasında bulunur ve bu bölgede yapısal rol oynar. α-tokoferol, otooksidasyonun başlatıcısı olan peroksit ve hidroperoksit radikallerini inhibe eder ⁷. Yeşil sebze ve meyvelerde bol miktarda bulunan ve vitamin A’nın öncül maddesi olan karoten de α-tokoferol gibi antioksidan özelliğe sahip bir bileşiktir. Son yıllarda, Tip 2 DM dışında hiperglisemi ile seyreden ve glukoz metabolizma bozuklukları olarak kabul edilen bozulmuş açlık glukozu (BAG) ve bozulmuş glukoz toleransı (BGT) tanımlanmıştır. Bu çalışma Tip 2 DM, BAG ve BGT olan hastalarda serum lipid peroksidasyonu, α-tokoferol ve β-karoten düzeylerindeki değişiklikleri araştırmak amacı ile planlanmıştır.

Hasta seçimi: Bu çalışmaya Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Tıp Fakültesi Uygulama ve Araştırma Hastanesi Aile Hekimliği ve Dahiliye polikliniklerine başvuran hastalar dahil edildi. Çalışmaya alınan kişiler çalışmanın niteliği hakkında sözel olarak bilgilendirilerek onayları alındı. Hastalardan 12 saat açlık sonrası ilk kan örnekleri alındı. Açlık kan şekeri (AKŞ) 110-140 mg/dl arasında olan kişiler çalışmaya alındı. AKŞ değerleri 110-125 mg/dl olan hastalara hiperglisemik glukoz metabolizma bozukluğunu sınıflandırmak amacıyla 75 gram glukozla oral glukoz tolerans testi (OGTT) uygulandı ve OGTT sonuçlarına göre hastalar iki gruba ayrıldı. Birinci gruba (BAG grubu) (n=31, 15 erkek, 16 kadın) BAG tanımına uygun olarak AKŞ=110 – 125 mg/dl ve 2. saat kan şekeri < 140 mg/dl olan hastalar, ikinci gruba da (BGT grubu) (n=34, 17 erkek, 17 kadın) BGT tanımına uygun olarak AKŞ < 125 mg/dl ve 2. saat kan şekeri 140- 200 mg/dl olan hastalar dahil edildi. Açlık kan şekeri iki kez 126 mg/dl ve üzerinde ölçülen hastalardan üçüncü grup (DM grubu) (n=34, 16 erkek, 18 kadın) oluşturuldu. Sağlıklı kişilerden de dördüncü grup (kontrol grubu) oluşturuldu (n=37, 18 erkek, 19 kadın). Gruplar arasında yaş, cinsiyet, sigara kullanımı ve alkol tüketimi bakımından anlamlı fark yoktu. Hastaların kan örnekleri santrifüj edilerek serumları ayrıldı. Serumlardan MDA, α-tokoferol ve β-karoten çalışıldı.

Malondialdehid (MDA) ölçümü: MDA ölçümünde Draper ve Hadley’in ⁸ tanımladığı metot kullanıldı. Reaksiyonun prensibi, MDA’nın alkali _pH da tiyobarbütirik asit ile reaksiyona girmesi sonucu 532 nm de maksimum absorbans veren pembe renkli bileşiğin oluşmasına dayanır.

Ölçülen absorbas değerleri MDA standart grafiği kullanılarak mol/L olarak hesaplandı.

α-tokoferol ölçümü: Serum α-tokoferol düzeyleri Hashim ve Schuttringer ⁹ tarafından tanımlanan metotla yapıldı. Önce serum örnekleri etanol ve n-heptan ile karıştırılıp vortekslendi ve 5 dakika 1000 devir/dk santrifüj edildi. Böylece proteinler çöktürülürken E vitamini n-heptan fazına geçti. Kör ve numune tüplerine üstte kalan n-heptan fazından 0.4 ml alındı. Üzerlerine 0.3 ml α- α’ dipyridyl eklenip karıştırıldı. 460 nm de köre karşı %T değerleri okundu. Daha sonra her iki tüpe 0.1 ml demir-3-klorür eklenerek karıştırıldı ve 4 dakika sonra 510 nm de köre karşı %T değerleri okundu. Serum α-tokoferol düzeyi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı.

α-tokoferol (mg/dl) =[(log510-1.36) –0.32.log460]/-0.4608 Sonuçlar 1000 ile çarpılarak µg/dl olarak ifade edildi.

β-karoten ölçümü: Total karotenlerin 450 nm. de verdiği absorbansın ölçülmesinden faydalanılarak, β-karoten düzeyi saptandı. Kısaca, bir deney tüpüne 0.75 ml plazma ve üzerine 2 ml etanol (%95) yavaşça karıştırılarak ilave edildi. Vorteksle de iyice karıştırıldı. Daha sonra 3 ml n-hekzan ilave edildi. Ağzı kapatılarak vorteksle en az bir dakika karıştırıldı. 3000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Üst hekzan fazının absorbansı spektrofotometrede 450 nm de hekzan körüne karşı ölçüldü. β-karotenin 450 nm hekzandaki molar ekstinksiyon katsayısından faydalanılarak miktarı µg/dl olarak hesaplandı ¹⁰.

İstatistiksel Değerlendirme
İstatistiksel değerlendirme Windows 2000 ortamında SPSS programı kullanılarak yapıldı. Grupların karşılaştırılmasında Oneway Anova testi kullanılırken, posthoc olarak da Tukey testi kullanıldı.

Sonuçlar Tablo 1’ de toplu olarak verilmiştir. DM grubunun MDA düzeyi BGT, BAG ve kontrol gruplarından anlamlı derecede yüksek bulunurken (p<0.001, p<0.001, p<0.001), α- tokoferol düzeyi kontrol grubundan (p<0.014), β-karoten düzeyi ise BGT, BAG ve kontrol gruplarından düşük(p<0.001, p<0.001, p<0.001) bulundu. BGT grubunun MDA düzeyi BAG ve kontrol gruplarından anlamlı derecede yüksek bulunurken (p<0.033, p<0.001), α-tokoferol düzeyi kontrol grubundan (p<0.01), β-karoten düzeyi ise BAG ve kontrol gruplarından düşük (p<0.001, p<0.001) bulundu. BAG grubu ile kontrol grubu arasında her üç parametre açısından da anlamlı fark yoktu.

Tablo 1: Çalışma gruplarında serum MDA, α-tokoferol ve β-karoten değerleri ve bu değerlerin ikili gruplar arasında karşılaştırmalarının p değerleri

DM, karmaşık bir patoloji tablosuyla izlenen bir durumdur. Son yıllarda bu tablonun oluşumunda etken faktörler arasında, hiperglisemiye bağlı oksidan ortam oluşumu üzerinde durulmaktadır. Hipergliseminin oksidan bir ortama neden olduğuna, önceden yapılmış birçok çalışmada işaret edilmiştir ¹¹. DM’li hastalarda gözlenen, katarakt, ateroskleroz, eritrositlerde bozukluk, lenfosit ve trombosit fonksiyon bozukluğu gibi bulgular, serbest radikallerin artmasıyla ilgili bulunmaktadır ^12,13. Tip 2 DM’nin patogenezi ve komplikasyonlarının gelişim mekanizmalarını açıklamak için hipergliseminin neden olduğu metabolik değişiklikler üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır ve hala yapılmaktadır ^14,15. Bu çalışmaların bir kısmı hiperglisemi ile serbest radikal üretimi arasındaki olası ilişkiyi araştırmaya yoğunlaşmıştır. Weidig ve arkadaşları yaptıkları hücre kültürü çalışmasında, hiperglisemiye maruz kalan koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde prooksidan enzim aktivitelerinde ve serbest radikallerin seviyesinde artış gözlendiğini bildirmişlerdir ¹⁶. Yüksek glukoz konsantrasyonunun ROT bileşiklerinin üretiminde artışa neden olduğu ve embriyonik dismorfogeneziste artmış süperoksit anyon radikalinin etkili olduğu Yang ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir ¹⁷. Başka bir çalışmada, hipergliseminin neden olduğu endotelial hücre proliferasyonunda süperoksit anyon radikali üretimindeki artışın etkili olduğu gösterilmiştir ¹⁸. Nishikawa ve arkadaşları hipergliseminin aktive ettiği oksidan metabolik yolların inhibisyonu ile mitokondrial süperoksit radikal üretiminin normale döndüğünü rapor etmişlerdir ¹⁹. Ayrıca hipergliseminin üretimine neden olduğu ileri glikasyon ürünlerinin de NADPH-oksidaz enzimi gibi bazı oksidan enzim aktivitelerini artırarak oksidan stres gelişimine katkıda bulundukları gösterilmiştir ²⁰. Bu ve benzeri çalışmalar, hipergliseminin ROT bileşiklerin üretimini artırdığını göstermektedir. ROT bileşikleri lipid, protein, nükleik asit gibi hücre bileşenlerini okside etme kapasitesine sahiptir. Özellikle hücre membran yapısında bulunan doymamış yağ asitleri oksidasyona duyarlıdır ve bunların oksidasyonu lipid peroksidasyon zincir reaksiyonlarının başlamasına neden olur. Bir reaksiyon zincirinin başlaması, diğer reaksiyon zincirlerinin başlama ve şiddetlenmesine neden olur ve bunun sonucunda yaygın peroksidasyon, membran lipid tabakasının yapısal bütünlüğünde bozulma, membran geçirgenliğinde artma, iyon transportunda bozulma ve son olarak lizis ortaya çıkar ²¹.

Oksidan stresin neden olduğu lipid peroksidasyonunun değerlendirilmesinde MDA yaygın olarak kullanılan bir parametredir. Çalışmamızda lipid peroksidasyon ürünü olan MDA düzeylerinin DM grubunda BAG, BGT ve kontrol gruplarına göre artmış olduğu, BGT grubunda BAG ve kontrol gruplarına göre artmış olduğu izlenmistir. BAG grubunda serum MDA seviyesi kontrol grubuna göre hafif yüksek olmakla birlikte istatistiki anlamda fark gözlenmemiştir. Bu durum yüksek glukoz düzeyinin oksidatif hasara yol açan sebeplerden biri olduğunu belirten literatür bilgileriyle doğrulanmaktadır ^22,23. Gopaul ve arkadaşları yaptıkları çalışmada BGT olan kişilerde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında lipid peroksidasyonunda artış olduğunu bildirmişlerdir ²⁴. Artmış olan oksidatif hasarın en azından kısmen hipergliseminin sonucu olarak geliştiği düşünülmektedir. Bütün hücreler ROT bileşiklerinin zararlı etkilerini önleyecek enzimatik ve nonenzimatik antioksidan savunma sistemine sahiptir. Glutatyon, α-tokoferol, beta karoten nonen-zimatik antioksidan sistemin önemli bileşenleridir ²⁵. α-tokoferol ve karotenoitler gibi antioksidanların önemli bir kaynağı besinlerdir. Önemli bir zincir kırıcı antioksidan olan α–tokoferol lipid peroksidasyonunu inhibe ederek, hücre zarında oluşacak olan hasarı ve düşük dansiteli lipoproteinlerin modifikasyonunu engeller. Karotenoitler ortamda bulunan moleküler oksijeni ve peroksil radikalini temizler. Antioksidanların diyetle alınmasının birçok hastalığın riskinin azalmasıyla ilişkili olduğuna dair epidemiyolojik çalışmalardan, hayvan deneylerinden ve in vitro deneylerden elde edilmiş kanıtlar her geçen gün artmaktadır ²⁵.

Çalışmamızda BGT ve Tip 2 DM gruplarında serum α-tokoferol düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşük bulunmuştur. Bu bulgularımız literatürle uyum göstermektedir. Ford ve arkadaşları diyabetli hasta grubunun serum α-tokoferol seviyesinin kontrol grubundan alamlı derecede düşük olduğunu bildirmişlerdir ²⁶. Sundaram ve arkadaşları, 467 Tip 2 DM hastası ve 180 kontrol üzerinde gerçekleştirdikleri bir çalışmada, hastalara tanı konulmasının 2. yılında lipid peroksidasyonunun belirgin şekilde arttığını, E vitamininin belirgin derecede azaldığını, bu değişikliklerin, hastalığın süresi ile korele olduğunu ve komplikasyon gelişmiş olan hastalarda farkın daha belirgin olduğunu göstermişlerdir ²⁷. Plazma α-tokoferol konsantrasyonunun sağlıklı kişilerde insülin rezistansı ile ters ilişki olduğu ^28,29, düşük serum vit E konsantrasyonlarının tip 2 DM riskini artırdığı bir prospektif kohort çalışma ile ortaya konmuştur ³⁰. Ayrıca kan glukoz, insülin düzeyleri ile α-tokoferol düzeyleri arasındaki ilişkiyi araştıran çalışmalar da bizim sonuçlarımızı desteklemektedir. Ylönen ve arkadaşları yaptıkları çalışmada diyetle alınan vit E ile açlık kan glukozu ve HbA1c düzeyi arasında ters ilişki olduğunu rapor etmişlerdir ³¹. Ayrıca daha önceden yapılan kesitsel çalışmalarda plazma tokoferol ve plazma açlık insülin konsantrasyonları arasında ters ilişki olduğu bildirilmiştir ^28,29 Bu çalışmalar, hasta grupların α-tokoferol düzeylerinin kontrol grubundan anlamlı derecede düşük bulunmuş olduğu bizim çalışmamızı desteklemektedir. Facchini ve arkadaşları yaptıkları çalışmada serum karotenoit konsantrasyonlarının açlık kan glukoz ve insülin konsantrasyonu ile ters ilişkili olduğunu bildirilmişlerdir ²⁸. Plazma tokoferol konsantrasyonunun sağlıklı kişilerde insülin resistansı ile ters ilişki olduğu ^28,29, düşük serum vit E konsantrasyonlarının tip 2 DM riskini artırdığı bir prospektif kohort çalışma ile ortaya konmuştur ³⁰. Decsi ve arkadaşları obes çocuklarda yaptıkları bir çalışmada plasma α -tokoferol değerleri ile açlık isülininin ters ilişkili olduğunu bildirmişlerdir ³². DM hastalarında α -tokoferol ve keratenoit düşüklüğünün nedeni bilinmemekle birlikte, alım ve/veya kullanımdaki değişiklikten kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Karotenoitler ve tokoferoller ile glukoz metabolizması arasındaki bağlantının biyolojik mekanizmaları hakkındaki bilgimiz oldukça kısıtlıdır. Tokoferol ve karotenoitlerin glukoz metabolizması ile ilişkilerinin antioksidan etkileri ile tam olarak açıklanabildiği söylenemez ^33-35.

Sonuç olarak hiperglisemi ile seyreden hastalıklarda lipid peroksidasyonu artarken, α -tokoferol ve β–karoten seviyelerinin düştüğü yaptığımız çalışmada ve benzeri çalışmalarda gösterilmiştir. Bundan dolayı, hiperglisemi ile seyreden hastalıkların önlenmesi ve komplikasyonlarından korunmada bu bilgilerin göz önünde tutulmasının ve E vitamini, karoten gibi doğal antioksidanlardan zengin gıdaların hastaların diyetlerine eklenmesinin faydalı olacağını düşünmekteyiz.