Birçok hücrede bulunan Nitrik Oksit Sentaz (NOS) enzimleri tarafından farklı uyarılar sonucu salıverilen Nitrik Oksitin (NO) fizyolojik rolleri ve karıştığı fizyopatolojik süreçler oldukça iyi tanımlanmıştır¹. Bazal ve indüklenebilir olarak salınan NO’in yarı ömrü oldukça kısadır ve süratle reaktif oksijen türleriyle reaksiyona girerek nitrit ve nitrat gibi ürünlere dönüştüğü bilinmektedir². Sentezlenen NO’in düzeyi; metabolitlerinin plazma, serum ve idrar gibi vücut sıvılarındaki miktarlarının ölçümleriyle dolaylı olarak belirlenebileceği gibi doğrudan NO ölçümleriyle de belirlenebilmektedir¹. NOS enzimini inhibe etmek için NG-nitro-L-arginin metil ester (LNAME) ve L-NNA gibi kimyasal maddeler kullanılmaktadır³. Herhangi bir uygulama yapılmamış sıçanların plazma NOx düzeyi yaklaşık 20 mikromolar düzeyinde iken kullanılan NOS inhibitörünün dozuna bağımlı olarak NOx konsantrasyonu değişiklik göstermektedir⁴. NOS inhibitörlerinin düşük dozda kullanımıyla organ hasarı ve gelişme bozukluğu meydana gelmezken, yüksek dozlarla yapılan NOS inhibisyonunda özellikle böbreklerde parankim ve damar hasarı olduğuna ve malign hipertansiyon geliştiğine dikkat çekilmektedir⁵. MDA lipid peroksidasyonun en iyi bilinen ürünüdür. Bu molekülün miktarı, in vivo ve in vitro oksidatif stresin düzeyini belirlemek amacıyla 1960’lardan beri kullanılmaktadır⁶. Kronik NOS inhibisyonu yapılan sıçanlarda plazma MDA düzeyinin arttığı gösterilmiş fakat akut doz NOS inhibisyonu ve plazma MDA düzeyi ile ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır⁷.

Bu çalışmada: sıçanlarda NOS inhibitörü L-NNA’ın akut ve kronik uygulamalarının, plazma NOx ve MDA düzeylerine etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir.

Denekler
Bu çalışmada 76 adet erkek Wistar albino türü sıçan kullanıldı. Bu çalışmanın prosedürleri ve protokolu Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul düzenlemelerine uygun olarak yapıldı. Sıçanlar 22-24ºC ve düzenli 12 saat ışık alan kontrollü sabit ortamda barındırıldı. Standart yem ve su serbest bırakıldı.

Deneysel prosedür
Sıçanlar 4 gruba ayrıldı ve bu gruplardan akut ve düşük doz kronik L-NNA uygulanan gruplardan ilaç uygulaması sürecinde farklı zamanlarda yapılan ölçümler dikkate alınarak alt gruplar oluşturuldu. Birinci grup kontrol olarak değerlendirildi ve kontrol grubu sıçanlarda sadece SKB ölçüldü ve kan örnekleri alındı (Grup kontrol, n=10). İkinci grupta akut L-NNA uygulamasının etkilerini belirlemek için sıçanlara SKB ölçümlerini takiben tek doz L-NNA uygulandı (Grup aL-NNA, n=19, 25mg/kg i.p.); bu grup daha sonra 3 alt gruba ayrılarak sırasıyla 1 (Grup aL-NNA1, n=4), 3 (Grup aL-NNA3, n=9) ve 24 saat (Grup aL-NNA24, n=6) sonra tekrar SKB ölçümleri yapıldı. Sıçanlardan 1, 3 ve 24. saatlerde kan örnekleri alındı. Bu kan örnekleri ikiye ayrılarak 1, 3 ve 24. saatlerde plazma NOx ölçümleri yapıldı. Bir ve 24. saatlerde plazma MDA düzeyleri ölçüldü. Üçüncü saatte sıçanlardan yeterince kan örneği alınamadığından sadece NOx ölçülebildi, MDA ölçümleri ise yapılamadı. Düşük doz kronik L-NNA uygulamasının etkilerini belirlemek için üçüncü gruba L-NNA içme suyuyla ≈15mg/100ml (Grup dL-NNA, n=19) konsantrasyonda 2 hafta süreyle uygulandı. dL-NNA grubundaki sıçanların bir kısmı 2 hafta sonunda hemen (Grup dL-NNA0, n=7), diğerleri ise L-NNA uygulamasına son verildikten 24 (Grup dL-NNA24, n=6) ve 48 (Grup dLNNA48, n=6) saat sonra test edildiler. Yüksek doz kronik LNNA uygulamasının etkilerini belirlemek için de dördüncü gruba L-NNA içme suyuyla ≈45mg/100ml (Grup yL-NNA, n=28) 2 hafta süreyle uygulandı ve L-NNA uygulamasına son verildikten hemen sonra sıçanların SKB ölçüldü ve kan örnekleri alındı. Çalışmada esas olarak akut L-NNA uygulamasının etkilerinin incelenmesi amaçlandığı için yLNNA grubu altguplara ayrılmadı.

Kan basıncı ölçümleri
Bilinci açık sıçanların kan basıncı ölçümleri kuyruktan indirekt tail-cuff metodu ile yapıldı (MAY BPHR 9610-PC TAİL-CUFF İndirect Blood Pressure Recorder, Commat Ltd. Ankara, Türkiye).

Kan örneklerinin alınması
Kan basıncı ölçümlerinden hemen sonra bütün gruplardaki sıçanlar üretan ile (1.4 gr/kg, i.p.) anesteziye edilerek sol ventrikülden kan örnekleri alındı. Anestezi altında önce abdomen sonra toraks açılarak enjektör ile apeksten sol ventriküle girilerek kan alındı. Alınan kan örnekleri ETDA’lı tüplere konularak 5000 g de 10 dakika süreyle santrüfüjlendi. Plazmalar ayrılarak ölçüm yapılana kadar (–20ºC ) saklandı.

Plazma NOx ölçümleri
Plazma NOx ölçümleri Cortas’ın çalıştığı metoda göre yapıldı . Plazmalardan 250µl alınarak üzerlerine 1 ml çinko sülfat, 1,250 µl (55 mmol/lt) sodyum hidroksit çözeltisi ilave edilerek proteinler çöktürüldü. Daha sonra 3500g de 10 dakika boyunca santrüfüjlendi. Üstteki çözelti kısmı alınarak üzerine 2ml distile su 1 ml glisin tamponu eklenerek bakır kaplı kadmiyum granüllerinin üzerine eklendikten sonra 90 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilerek ortamda bulunan nitrat, nitrite indirgendi. Numunelerden 2 ml alınarak üzerine 1 ml sülfanilamid 1 ml naftiletilendiamin çözeltisi 0.5 ml distile su ilave edildi ve 10 dakika bekletildikten sonra spektrofotometre ile 545 nm dalga boyunda ölçüm yapıldı. Numunelerin konsantrasyon değerleri, elde edilen absorbans değerlerinin kalibrasyon eğrisine yerleştirilmesiyle hesaplandı.

Plazma MDA ölçümleri
Plazma MDA ölçümleri Tsaknis ve ark. nın çalıştığı metoda göre yapıldı . Kısaca 0.25 ml plazma alınarak üzerine HclO₄ (0.25ml 0.5M) ilave edilerek proteinler çöktürüldükten sonra saf su ilave edilerek toplam hacim 1ml ye tamamlandı. Karışım 4500 devirde (rpm) 5 dakika santrüfüjlendi. Berrak kısımdan 20 µl alınarak HPLC de analiz edildi. Analizler hareketli faz olarak 0.5gr KH₂PO_4-metanol (%65-35; pH:4 ortamı asitlendirmek için %10’luk H₃PO₄ ilave edildi.) karışımında 254 nm de SGE marka Wakosill II 5C18RS 5 µm (150X4.6mm SS) kolonu kullanılarak akış hızı 1.5mL/dakikaya ayarlanarak yapıldı.

Kullanılan kimyasal maddeler
L-NNA, N-(-1-naphthyl)-etilendiamin dihidroklorid, glisin hidroklorid Sigma Aldrich Inc. den (St. Louis, MO. A.B.D.), perklorik asit, potasyum fosfat, metanol, fosforik asit, bakır sülfat pentahidrat, sodyum nitrit, sodyum hidroksit, sülfanilamid Merk KgaA dan (Darmstadt, Almanya), granül kadmiyum Fluka Chemie den (Steinheim, İsviçre), çinko sülfat heptahidrat Carlo Erba dan (Milano, İtalya) satın alındı.

İstatistik
Elde edilen veriler ortalama±standart hata olarak ‘Origin 5.0’ istatistik programı kullanılarak Student-t testi ile belirlendi. p<0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Tek doz L-NNA uygulamasının S KB, plazma NOx ve MDA düzeylerine etkisi
Sistolik kan basıncı ölçülen sürelerle ilişkili olarak 1. ve 3. saatlerde yükselmiş fakat 24. saatte düşmüştür (mmHg; kontrol 127±1.9; aL-NNA1155.5±1.7; aL-NNA3 153±1.5; aL-NNA24 147±4.8). Alınan kan örneklerinde yapılan NOx ölçümlerinde ilginç olarak 1.saatte plazma NOx değerleri değişmemiştir, ancak 3.saatte anlamlı olarak düşük bulunmuş ve 24. saatte ise plazma NOx değerleri normale dönmüştür (µmol/L; kontrol 29±0.1; aL-NNA1 30±0.2; aL-NNA3 11±0; aL-NNA24 30±0.2). Ayrıca tek doz L-NNA uygulaması plazma MDA değerlerini de kontrol grubuna göre anlamlı olarak yükseltmiştir (ppm; kontrol 1.6±0.1; aL-NNA1 2.2±0.2; aLNNA24 3.1±0.02), (Tablo 1).

Tablo 1: Kontrol ve aL-NNA alt gruplarının SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

Yüksek doz kronik L-NNA uygulamasının SKB, plazma NOx ve MDA üzerine etkisi
Yüksek doz L-NNA uygulanan grubun SKB değerleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yükselmiştir (mmHg; kontrol 127±1.9; yL-NNA 167.1±3.2). LNNA uygulamasının sonlandırılmasından sonra alınan plazma örneklerinde yapılan NOx ölçümlerinde NOx değerlerinin anlamlı olarak yükseldiği bulunmuştur (µmol/L; kontrol 29±0.1; yL-NNA 35±0.1). Plazma MDA değerlerinin de anlamlı olarak yükseldiği bulunmuştur (ppm; kontrol 1.6±0.1; yL-NNA 4.2±0.2). (Tablo 2).

Tablo 2: Kontrol ve yL-NNA gruplarının SKB. plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

Düşük doz kronik L-NNA uygulamasının SKB, plazma NOx ve MDA üzerine etkisi Düşük doz L-NNA uygulanan grubun SKB değerleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yükselmiştir (mmHg; kontrol 127±1.9, dL-NNA 156.6±2.5). Plazma NOx değerleri ise L-NNA uygulaması sonunda değişmemiş, L-NNA uygulamasına son verildikten 24 saat anlamlı olarak düşmüş fakat 48 saat sonra normale dönmüştür (µmol/L; kontrol 29±0.1; dL-NNA0 28±0.1; dL-NNA24 24±0.1 ve dL-NNA48 26±0.1). Yine benzer şekilde düşük doz L-NNA uygulanan grupta plazma MDA düzeyi ile kontrol grubu karşılaştırıldığında anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (ppm; kontrol 1.6±0.1; dL-NNA0 1.8±0.2). İlginç olarak düşük konsantrasyon L-NNA uygulamasına son verildikten 24 ve 48 saat sonra plazma MDA düzeylerinde artış tespit edilmiştir (ppm; kontrol 1.6±0.1; dL-NNA24 2.5±0.3; dL-NNA48 2.6±0.3), (Tablo 3). Tablo 3: Kontrol ve dL-NNA grubunun SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

Plazma NOx düzeyleri ile NO sentez ve salıverilmesi arasında negatif bir korelasyonun söz konusu olduğu, NOS inhibitörlerinin uygulanmasıyla NO sentezinin ve buna bağlı olarak plazma NOx düzeylerinin de azaldığı bilinmektedir¹. Bu çalışmada, NOS inhibitörü L-NNA’ nın tek doz uygulamasını takiben plazma NOx düzeylerinin 1. saatte değişmediği, 3. saatte kontrol grubuna göre anlamlı olarak düştüğü ve 24 saat sonra normal değerine döndüğü tespit edilmiştir. Buna bağlı olarak 1. saatte SKB yükselirken plazma NOx düzeylerinin değişmemesi NOS enzimlerinin inhibe olduğunu fakat organizmada halen var olan NOx ların etkin bir şekilde elimine olamadığını, 3. saatte SKB anlamlı olarak yüksek iken plazma NOx düzeylerinin anlamlı olarak düşmesi, NOx eliminasyonunun zamana bağımlı olduğunu düşündürmektedir.

NOS inhibitörlerinin kronik uygulamalarıyla plazma NOx değişimi arasındaki ilişkiler farklılık göstermektedir. Uzun süreli NOS inhibitörü uygulandığında plazma NOx düzeylerinin azaldığı, arttığı veya değişmediği bildirilmiştir^7,10,14. Bu çalışma da, yüksek doz L-NNA uygulaması sonucu SKB’nın anlamlı olarak artmasına rağmen plazma NOx düzeylerinin de yükseldiği ve aynı süre fakat daha düşük doz L-NNA uygulandığında ise SKB nın arttığı ancak plazma NOx düzeylerinin değişmediği tespit edilmiştir. İlginç olarak düşük doz L-NNA uygulamasına son verildikten 24 saat sonra plazma NOx düzeyleri anlamlı olarak düşmüş ve fakat 48 saat sonra normale dönmüştür. Çelişkili sonuçlar iNOS’un muhtemel aktivasyonuyla ve/veya NOx eliminasyonuyla ilişkili olabilir¹⁰. Farklı çalışmalarda farklı NOS inhibitörlerinin uygulama süreleri ve özellikle kan örneklerinin alınma zamanı da önem arz edebilir.

Lipid peroksidasyonunun en iyi bilinen ürünü olan MDA’nın plazma düzeyi oksidatif stresin bir göstergesidir⁶. Tavşanlarda akciğer iskemi-reperfüzyon hasarı ve endotoksin indüklü akciğer hasarında, sıçanlarda akut nekrotik pankreatitte akut L-NNA uygulamaları sonucu oksidatif hasarın bir göstergesi olarak MDA düzeyinin yükseldiği bildirilmiştir^11-13. Yine hipoksik hasar olusturulan yenidoğan sıçanlarda LNNA’nın intestinal dokuda MDA düzeyini arttırdığı bildirilmiştir¹⁴. Öncekilerden farklı olarak bu çalışmada LNNA herhangi bir hasar oluşturulmamış sıçanlara uygulandı ve bu uygulamanın plazma MDA düzeyine etkileri incelendi. Çalışmada tek doz L-NNA uygulamasını takiben 1. saatte plazma MDA düzeyinin kontrol grubuna göre yüksek çıkması ve 24. saatte de bu yükselişini devam ettirmesi, akut L-NNA uygulamasının oksidatif hasara neden olduğunu düşündürmektedir. Kronik NOS inhibisyonu uygulamasında ise sıçanların plazma MDA düzeyinin arttığını belirten çalışmaların yanı sıra NOS inhibisyonu ile plazma MDA düzeyinin değişmediğini belirten çalışmalara da rastlanmaktadır^7,15. Akut uygulamalardakine benzer şekilde dimetilnitrozamin indüklü kronik hepatit olusturulan sıçanlara L-NNA uygulandığında karaciğer hasarının şiddetlendiği ve karaciğer MDA düzeyinin arttığı gösterilmiştir¹⁶. Bu çalışmada da, kronik L-NNA uygulamalarında, yüksek doz LNNA uygulaması sıçanların plazma MDA düzeylerini anlamlı olarak yükseltmiştir. Plazma MDA düzeylerindeki bu yükselme yine L-NNA’nın oksidatif hasara bağlı toksik etkisini göstermektedir. Husain’in 8 hafta boyunca 10mg/kg, s.c. LNAME uyguladığı sıçanların plazma MDA düzeylerinde anlamlı bir yükselme olması bu çalışma ile uyumluluk göstermektedir⁷. Ancak, daha düşük doz L-NNA uygulamasında ise plazma MDA düzeylerinde kontrol grubuna göre farklılık tespit edilmemiştir. İlginç olarak, bu sıçanlarda L-NNA uygulamasına son verildikten 24 ve 48 saat sonra plazma MDA düzeyleri anlamlı olarak yükselmiştir. Düşük doz L-NNA uygulamasında, oksidatif strese karsı bir adaptasyon gelişmesi ve fakat kronik L-NNA uygulamasına son verilmesinin de bizzat oksidatif strese yol açabileceği düşünülebilir.

Sonuç olarak, bu çalışma tek doz L-NNA uygulamasını takiben zamana bağlı olarak SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeylerinin ölçüldüğü ilk çalışmadır. Elde edilen bulgular akut L-NNA uygulamasının oksidatif strese yol açtığına işaret etmekte, kronik uygulamalarda ise yüksek doz L-NNA’nın oksidatif hasara bağlı olarak plazma MDA düzeyini arttırdığını fakat düşük doz L-NNA’nın MDA düzeyini değiştirmediğini göstermektedir.