Adriamisin (ADR), solid tümörler dahil olmak üzere çeşitli hematolojik malignitelerin tedavisinde antineoplastik ajan olarak uzun yıllardır kullanılan bir antrasiklin grubu antibiyotiktir ¹. Böbrekler üzerindeki ciddi yan etkileri ve çeşitli organlardaki toksisitesi nedeniyle klinik kullanımı sınırlıdır ^2-4. ADR kaynaklı böbrek toksisitenin kesin mekanizması bilinmemekle birlikte ana patolojik mekanizmanın oksidatif stres ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu içerdiği görülmektedir ⁵. ROS, proapoptotik Bcl-2 proteinlerini etkileyerek ya doğrudan ya da dolaylı olarak mitokondriyal hasara yol açar ⁶. ROS üretiminin primer kaynağı olan mitokondri metabolik ve hücresel stres tepkilerine hızla yanıt veren, sürekli olarak antagonistik fisyon ve füzyon süreçlerinden geçen son derece dinamik organellerdir ^7,8. Füzyon, artan ATP üretimi ile ilişkiliyken, fisyon bozulmuş oksidatif fosforilasyon ve ROS üretimi ile ilişkilidir ⁹. Dengeli mitokondriyal dinamikler, fonksiyonel mitokondrinin korunması, enerji üretimi ve apoptozun önlenmesi için kritik rol oynarken, anormal mitokondriyal dinamikler tümör, diabetes mellitus ve pulmoner fibroz gibi çeşitli hastalıkların patogenezi ile ilişkilidir ^10,11. Dinamin bağımlı protein 1 (DRP1), fragmantasyonu sağlamak için mitokondriyal dış zara katılarak fisyonu gerçekleştiren sitoplazmik bir proteindir ¹¹. Artan ROS ile ilişkili mitokondriyal fisyonun mitokondriyal hasara ve fragmentasyona yol açtığı bildirilmiştir ¹². Ek olarak, in-vitro ve in-vivo mide kanseri modellerini kullanan çalışmalarda, ADR ile indüklenen apoptozun mitokondriyal fisyon aracılığıyla gerçekleştiği gösterilmiştir ^13,14. Bununla birlikte, ADR kaynaklı mitokondriyal fisyon aracılı apoptozun kesin moleküler mekanizması tam olarak anlaşılmamıştır.

Mitokondriyal disfonksiyonu ve oksidatif stresi azaltmak için antioksidan ajanlar ve mitokondriyal hedefli moleküller ADR kaynaklı hasarlarda terapötik bir strateji olarak önerilmiştir. Alfalipoik asit (1,2-ditiyolan-3-pentanoik asit, ALA), mitokondride lipoik asit sentaz tarafından üretilen mitokondriyal enzimler için kofaktör olan güçlü bir antioksidandır ¹⁵. ALA'nın ve indirgenmiş formu olan dihidrolipoik asidin terapötik aktivitesi, metal şelatlama kabiliyeti, ROS süpürücü etkisi, oksidatif hasarı onarma yeteneği ve C vitamini, E vitamini ve glutatyon gibi endojen antioksidanların rejenerasyonunu içeren antioksidan özelliklerine dayanmaktadır ¹⁶.

ADR'ye bağlı olarak ortaya çıkan serbest radikal aracılı toksisiteye karşı ALA'nın sitoprotektif etkisi ortaya koyulmuştur ¹⁷. Fakat ALA’nın ADR kaynaklı nefrotoksititeye karşı koruyucu etkisinin böbrek dokusundaki DRP1 ile ilişkisi bilinmemektedir.

Bu çalışmanın amacı, histolojik ve moleküler analizleri kullanarak ALA’nın ADR ile indüklenen böbrek hasarı üzerindeki muhtemel koruyucu etkisini değerlendirmektir. Ayrıca, DRP1'in terapötik bir hedef olarak önemini ele almak ve böylece çeşitli hastalıkların patogenezindeki rolünü anlamak için araştırma yaparak, DRP1 gibi hayati aracıların ve bunların çevresindeki mekanizmaların ortaya çıkmasına katkı sağlamaktır.

Çalışma, Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’nun 2018/02 sayılı 23 no’lu kararı gereğince etik yönden uygun bulunarak yapılmıştır.

Çalışmada Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırma Merkezi (FÜDAM)’nden temin edilen 200-250 gr ağırlığında 8-10 haftalık 28 adet Sprague-Dawley cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları sıçan pelet yemi ve musluk suyu ile beslendikleri 12 saat (07:00-19:00) aydınlık 12 saat (19:00-07:00) karanlıkta, 21±1 ˚C ortam sıcaklığında tutuldu. Sıçanlar; kontrol, ADR, ADR+ ALA ve ALA olmak üzere rastgele seçilerek 4 gruba ayrıldı (n =7). Kontrol grubuna deney süresi olan yirmi sekiz gün boyunca herhangi bir uygulama yapılmadı. ADR ve ADR+ALA grubuna deneyin birinci günü 15 mg/kg dozunda adriamisin intraperitonal (i.p.) olarak tek doz uygulandı. ADR+ALA ve ALA gruplarına ise serum fizyolojikte çözdürülmüş 50 mg/kg dozunda alfa lipoik asit (cat: 29,862 Lot: 002241–20,161,019, DL-a-Lipoic acid, Chem-Impex Int’l Inc, USA) deney süresi olan yirmi sekiz gün boyunca gün aşırı oral gavaj yoluyla verildi (18, 19). Deney süresi sonunda tüm gruplardaki sıçanlar ketamin (75mg/kg) + xylazine (10mg/kg) i.p uygulanarak anestezi altında dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından sıçanların böbrek dokuları hızla çıkarılıp bir kısmı histopatolojik değerlendirmeler için %10’luk formaldehit solüsyonuna alınırken, diğer bir kısmı ise moleküler analizler için -80º C’de muhafaza edildi.

Histopatolojik Değerlendirme
Histopatolojik değerlendirmeler için 24 saat süre ile %10’luk formaldehit içerisinde fikse edilen böbrek dokuları çeşme suyu altında yıkandı. Yıkanan dokular rutin histolojik takip serilerinden geçirilerek parafin bloklara gömüldü. Elde edilen parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Hazırlanan preparatlar Hematoksilen-Eozin (H&E) ile boyanarak ışık mikroskobu altında (Novel N-800M x20) incelendi ve fotoğraflandı. Değişiklikler histopatolojik durumlarına göre yok (0), hafif (1), orta (2) ve şiddetli (3) olarak değerlendirilerek histoskor tablosu yapıldı. Tüm histolojik değerlendirmeler, iki araştırmacı tarafından körleme yöntemiyle yapıldı.

İmmünohistokimyasal Değerlendirme
Böbrek dokusunda DRP1 immünreaktivitesinin belirlenmesi için, parafin bloklardan polilizinli lamlara 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Deparafinizasyon ve şeffaflaştırma işleminden sonra dokular azalan dereceli alkol serilerinden geçirilerek sitrat tampon solüsyonunda pH: 6’da mikrodalga fırında (750W) 12 dakika kaynatıldı. Endojen peroksidaz aktivitesini önlemek için hidrojen peroksit bloker (TA-125-HP Lot No: HP18180, Hydrogen Peroxide Block, Thermo Scientific) uygulandı. Zemin boyasını engellemek için 5 dakika Ultra V Block (TA-125-UB, Ultra V Block, Thermo Scientific) işleminden sonra primer antikor (YID5389 lot No: YL190228093, Polyclonal Anti-DRP1 Antibody) damlatılan dokular bir saat oda ısısında karanlık ve nemli ortamda inkübe edildi. İnkübasyondan sonra dokular sekonder antikor (TP–060-BN, Biotinylated Goat Anti-Poliyvalent (anti-mouse / rabbit IgG), Ther-mo Scientific) ile muamele edildi. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobu altında (Novel N-800M) incelenerek değerlendirildi. İmmünohistokimyasal boyanmanın değerlendirilmesinde; immünreaktivitenin yaygınlığı (0.1: <%25, 0.4: %26-50, 0.6: %51-75, 0.9: %76-100) ve şiddeti (0: yok, +0.5: çok az, +1: az, +2: orta, +3: şiddetli) esas alınarak histoskor tablosu oluşturuldu.

Kantitatif RT-PCR Yöntemi
Çalışmada DRP1, BCL-2 ilişkili protein X (BAX) ve Kaspase 3 (CASP3) genlerinin mRNA düzeylerindeki ifade farklılıklarının tespiti için qRT-PCR yöntemi kullanıldı.

Total RNA İzolasyonu
-80 °C’de muhafaza edilen sıçan böbrek dokusuna ait örneklerden total RNA izolasyonu için Trizol (MG-TRZ-01, Hibrigen, Türkiye) kullanıldı. Üretici firma tarafından önerilen protokole uyularak RNA izolasyonu yapıldı. RNA miktarları, nanodrop cihazında (BioS-pec‐nano, Shimadzu) ölçüldü. Her gruba ait RNA örnekleri, eşit düzeyde total RNA içerecek şekilde, kendilerine ait havuzlarda toplandı.

Komplementer DNA Sentezi
Çalışmaya konu olan genlerin mRNA düzeylerindeki ifade farklılıklarının tespitinde kullanılan komplementer DNA (cDNA)’lar için her bir grubu temsil eden havuz yapılmış RNA örneklerinden 10 μl kullanıldı. cDNA sentezi, OneScript Plus cDNA sentez kiti (abm, Kanada) kullanılarak üretici firmanın önerdiği protokole uygun şekilde gerçekleştirildi. Elde edilen cDNA örnekleri -20 °C’de saklandı.

Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Komplementer DNA Amplifikasyonu
Elde edilen cDNA’lar, dizi spesifik primerler varlığında qRT-PCR aracılığıyla amplifiye edildi. Sıçan böbrek örneklerindeki mRNA ifade düzeyleri incelenirken Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) referans gen olarak kullanıldı (Tablo 1).

Tablo 1: Çalışmada kullanılan qRT-PCR primerleri.

qRT-PCR analizi, 96 kuyucuklu platelerde, toplamda 10 μl hacimde (1 μl cDNA ve 9 μl karışım) üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi. Bu analiz, 2X Magic SYBR Mix (Procomcure, Avusturya) kullanılarak Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR sisteminde üretici firmanın belirttiği protokole uygun şekilde gerçekleştirildi. Analizler sonucunda mRNA ifadeleri arasındaki farklılıkların hesaplanmasında 2-ΔΔCT metodu kullanıldı.

İstatistiksel Analiz
Çalışmada örneklem büyüklüğü hesaplanırken GPower 3.1 (http:/www.gpower.hhu.de/) programı kullanıldı. Yapılan güç analizine göre, çalışmada kullanılan değişkenler için %95 güç ve 0.05 anlamlılık belirleyebilmek için her grup için en az 7 adet sıçan çalışmaya alındı. Tüm istatistiksel analizler SPSS 22.0 (Statistical Package for Social Sciences) paket programında yapıldı. Elde edilen değerler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Tüm analizlerde p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Normal dağılım gösteren çoklu grupların aralarındaki farklılıkları test etmek için Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA), ikili karş-laştırmalar için ise Posthoc Tukey testi kullanıldı.

Histopatolojik Bulgular
Işık mikroskobik incelemede hem kontrol hem de ALA gruplarının böbrek kesitleri için anormal bir histopatolojik bulguya rastlanılmadı. Glomerüller, bowman mesafesi ve tübüler yapılar normal histolojik yapı gösterdi (Şekil 1A ve B).

Şekil 1A: ADR ve/veya ALA uygulamalarının sıçan böbrek dokusu üzerindeki etkilerinin fotomikrografları: A; Kontrol grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde glomerül ve tübüler yapılar normal olarak ayırt edildi.

Şekil 1B: ALA grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde glomerüller ve tübüller normal bir histolojik yapı gösterdi.

Sadece ADR verilen gruba ait preparatlarda yapılan incelemeler sonucunda renal glomerül ve tübüllerde dejeneratif değişiklikler görüldü. Kesitlerde atrofik glomerüller, renal tübül epitellerinde deskuamasyon ve dejenerasyon, Bowman boşluğunda genişleme, vasküler konjesyon, proksimal tübül epitellerine ait fırçamsı kenarlarında bozulma ve ayrılmalar, tübüllerde hiyalin birikimi, tübüler vakuolizasyon, peritübüler ödem ve intertisyel infiltrasyon bulguları izlendi (Şekil 1D, E, F).

Şekil 1D: ADR grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde peritübüler ödem (yıldız), vasküler konjesyon (ok başı) ve tübüler vakuolizasyon (ince ok) gözlendi.

Şekil 1E: ADR grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde renal tübül epitellerinde deskuamasyon ve dejenerasyon (ince ok) ve atrofik glomerül yapıları (kalın ok) izlendi

Şekil 1F: ADR+ALA grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde hafif derecede intertisyel infiltrasyon (kalın ok), ve vasküler konjesyon (ok başı) ve yer yer renal tübül epitellerinde deskuamasyon (ince ok) izlendi. Sıçanların ALA ile tedavisi ADR kaynaklı histopatolojik değişiklikleri açıkça hafifletti. Hematoksilen & Eozin, x20. ADR: Adriamisin; ALA: Alfa lipoik asit.

Şekil 1C: ADR grubuna ait böbrek dokusu kesitlerinde tübüllerde hiyalin birikimi (yıldız), yoğun intertisyel infiltrasyon (kalın ok), proksimal tübül epitellerine ait fırçamsı kenarlarında bozulma ve ayrılmalar (ince yıldız) ve Bowman boşluğunda genişleme (iki başlı ok) gözlendi.

ADR+ALA grubuna ait böbreklerin histolojik incelenmesinde tek başına ADR uygulanan grubta gözlenen histopatolojik değişikliklerin istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05) bir şekilde azalma gösterdiği, sadece bazı alanlarda orta derecede infiltrasyon, vasküler konjesyon ve yer yer renal tübül epitellerinde deskuamasyon bulguları izlendi (sırasıyla; p =0.008, p =0.038, p =0.008) (Şekil 1C).

Histolojik değerlendirmelere ait histoskor sonuçları tablo 2’de gösterilmektedir.

Tablo 2: Böbrek dokusundaki histolojik değerlendirmelere ait histoskor tablosu.

İmmünohistokimyasal Bulgular
DRP1 immünreaktivitesi için yapılan immünohistokimyasal boyamanın ışık mikroskobu altında incelenmesi sonucu; böbrek tübüllerinde ve glomerül yapılarında pozitiflik gözlendi (Şekil 2). Kontrol ve ALA grubuna ait DRP1 immünreaktivitelerinin benzer olduğu gözlendi (p =0.991) (Şekil 2A, D).

Şekil 2A, D: ADR ve / veya ALA uygulamalarının sıçan böbrek dokusu üzerindeki Drp1 immünreaktivitesine etkileri: Oklar gruplardaki DRP1 immünreaktivitesini göstermekte. Sırasıyla kontrol ve ALA gruplarına ait böbrek tübüllerinde ve glomerül yapılarındaki DRP1 immünreaktivitesinin benzer olduğu (p >0.05) izlendi.

ADR grubunda, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı bir artış vardı (p <0.05) (Şekil 2B).

Şekil 2B: ADR grubuna ait DRP1 immünreaktivitesinin kontrol grubuyla karşılaştırıldığında böbrek tübüllerinde ve glomerül yapılarında istatistiksel olarak anlamlı oranda (p <0.05) artış olduğu gözlendi.

ADR+ALA grubunda ise, ADR grubu ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlendi (p =0.008) (Şekil 2C) (sırasıyla; 0.48±0.18, 0.55± 0.19, 2.18±0.48, 1.31±0.72).

Şekil 2C: ADR+ALA grubuna ait böbrek tübüllerinde ve glomerül yapılarında ADR grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı oranda (p <0.05) azalan DRP1 immünreaktivitesi tespit edildi.

DRP1 immünoreaktivite histoskor sonuçları tablo 3’de gösterilmektedir.

Tablo 3: Gruplardaki böbrek dokusuna ait DRP1 immünreaktivitesi histoskor sonuçları.

Kantitatif RT-PCR Bulguları
Kontrol grubuna kıyasla, yalnızca ADR grubunda; DRP1, BAX ve CASP3 mRNA düzeylerinde istatistiki açıdan anlamlı bir artış tespit edildi (sırasıyla; p =0.013, p =0.015 ve p =0.018). ADR+ALA grubunda ADR grubuna kıyasla DRP1, BAX ve CASP3 mRNA düzeylerinde (sırasıyla; p =0.024, p =0.038 ve p =0.031) anlamlı bir azalma tespit edildi. ALA grubunda da ADR grubuna kıyasla DRP1, BAX ve CASP3 mRNA düzeylerinde (sırasıyla; p =0.010, p =0.010 ve p =0.011) anlamlı bir azalma belirlendi. ADR+ALA grubuna kıyasla ALA grubunda mRNA düzeylerinin hiçbirinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim gözlenmedi (sırasıyla; p =0.109, p =0.083 ve p =0.121) (Şekil 3).

Şekil 3: ADR ve/veya ALA uygulamalarının sıçan böbrek dokusu üzerindeki ilgili genlerin mRNA ifadeleri üzerine etkileri.

Bu çalışmada, ilk hedefimiz doku hasarında ADR ile ilişkili DRP1 aktivitesi arasındaki bağlantıyı ve azalmış DRP1 ekspresyonları ile ALA'nın koruyucu etkileri arasındaki ilişkiyi göstermekti. Ayrıca, böbrekte ADR’nin neden olduğu doku hasarı ile birlikte bu hasara karşı ALA’nın iyileştirici etkisi histopatolojik değerlendirmelerle ve moleküler analizlerle ortaya koyuldu. Kinin içeren antrasiklin grubu bir antibiyotik olan ADR, 1969'dan beri kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Yüksek antitümör etkinliğine rağmen, ADR'nin kemoterapide kullanımı kardiyak, renal, pulmoner, testiküler ve hematolojik toksisiteleri nedeniyle büyük ölçüde sınırlandırılmıştır ^1,2,19,20 ADR ile indüklenen nefrotoksisitenin kesin mekanizması bilinmemekle birlikte, toksisitenin serbest radikal oluşumu, biyolojik makromoleküllerin demire bağlı oksidatif hasarı, membran lipit peroksidasyonu (LPO) ve aşırı miktarlarda üretilen ROS aracılığıyla olabileceğine inanılmaktadır ²¹. Ayla ve arkadaşlarının ³ yaptıkları çalışmada sıçan böbreklerinde 20 mg / kg tek doz ADR enjeksiyonu ile meydana gelen değişikliklerin artmış bowman boşluğu ve glomerüler kapillerlerde genişleme, tübüllerde dejenerasyon ve vakuolizasyon ile birlikte mikrovillus kaybını içeren bulgular olduğu belirtilmiştir. Diğer çalışmalarda da yine ADR’nin böbrekte glomerüler kapiller permeabilitesinde artışa, tübüler atrofiye, intertisyel lenfositik infiltrasyona, glomerüllerde mezengial genişlemeye ve lümende hiyalin birikimine yol açtığı ifade edilmiştir ^19,22,23. Biz de yaptığımız çalışmada 15 mg/kg i.p ADR uygulamasının böbrek dokusunda tübül epitellerinde dejenerasyon, intertisyel infiltrasyon, geniş intertübüler kanama alanları, glomerüler atrofi, tübülerde dejenerasyon ve vakuolizasyon, bowman boşluğunda genişleme gibi histopatolojik bulgulara neden olduğunu saptadık. Çalışmamızın sonuçları, ADR grubunda önemli renal hasarlar olduğunu ortaya koydu.

ADR, serbest oksijen radikalleri ve antioksidanlar arasında bir dengesizliğe yol açarak endojen antioksidanların tükenmesine ve doku hasarlarının meydana gelmesine neden olur ²⁴. Bu amaçla antioksidanların koruyucu ajanlar olarak kullanılması, ADR kaynaklı nefrotoksisite için potansiyel bir çözüm olabilir. Enerji üretiminde görev alan, pirüvat dehidrojenaz ve α-ketoglutarat dehidrojenaz kompleksleri gibi çeşitli mitokondriyal enzimler için kofaktör olan ALA güçlü bir antioksidandır ¹⁵. ALA, serbest radikal hasarını başlatan molekülleri temizleme kabiliyetleri ve LPO’yu önlemesi nedenleriyle oldukça fazla araştırılmış ve yüksek singlet oksijen söndürme sabiti olması nedeniyle de evrensel antioksidan olarak kabul edilmiştir ²⁵. Malarkodi ve arkadaşlarının ²⁶ yaptıkları çalışmada 7.5 mg / kg tek doz ADR uygulaması ile LPO göstergesi olan malondialdehit seviyelerinin arttığı, katalaz, süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz antioksidan enzim aktivitelerinin ise azaldığı, ALA ile yapılan ön tedavinin ise lipit peroksitlerdeki artışı önleyerek ve antioksidan enzim seviyelerini arttırarak ADR’nin neden olduğu nefrotoksisitede etkili bir şekilde iyileşme sağladığı gösterilmiştir. Yapılan başka bir çalışmada ALA ile 7 ve 14 günlük ön tedavinin ADR kaynaklı böbrek dokusunda gözlenen histopatolojik bulguları hafiflettiği bildirilmiştir ¹⁹. Çalışmamızda ise ADR uygulandıktan sonra tedavi amacıyla kullanılan ALA’nın diğer araştırma sonuçlarına benzer şekilde ADR ile artan histopatolojik bulgularda azalmaya yol açarak koruma sağladığını tespit ettik.

Mitokondri, dokudaki ADR'nin neden olduğu hücre hasarındaki hedeflerden biri olarak tanımlanmıştır ^1,2,7. Mitokondrinin birçok işlevi, füzyon ve fisyon arasında hassas bir denge olan morfolojileriyle yakından bağlantılıdır ⁹. Hem mitokondriyal füzyon hem de fisyon, mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesine ve optimizasyonuna katkıda bulunur ²⁷. DRP1, mitokondriyal fisyonun önemli bir düzenleyicisidir ¹³. Kültürlenmiş kas hücrelerinde, mitokondriyal fisyon inhibisyonun palmitatla indüklenen mitokondriyal disfonksiyona karşı koruma sağladığı bildirilmiştir ²⁸. Bununla birlikte mitokondriyal fisyonun podosit hasarına yol açan önemli bir faktör olduğu gösterilmiştir ²⁹. Yapılan bir çalışmada, mitokondriyal fisyon proteini DRP1 inhibisyonunun aldosteron kaynaklı mitokondriyal disfonksiyonu ve podosit hasarını baskıladığını bulmuştur ³⁰. Bunun yanı sıra, ADR’nin çeşitli kanser hücrelerinde mitokondriyal fisyonu arttırarak mitokondriyal parçalanmaya yol açtığı, bunun altında yatan mekanizmanın ise yüksek miktarda üretilen ROS, serbest radikaller ve peroksinitrit gibi diğer toksik maddelerin olduğu bildirilmiştir ^13,14,31. Mitokondriyal fisyonun apoptotik süreçlerde de rol oynadığı bilinmektedir ³². DRP1'in hücre stresörlerine maruz kalması üzerine mitokondriyal membran fragmantasyonunu başlatmak için sitozolden mitokondriye yer değiştirdiği, DRP1'in mitokondride birikerek sitokrom c'nin sitozole salınmasını daha da teşvik ettiği ve sonuçta apoptoza yol açtığı gösterilmiştir ^13,33. Disfonksiyonel mitokondri, fragmantasyon ve membran depolarizasyonu sergiler, büyük miktarlarda ROS üretir ve sonunda mitokondriyal hücre ölüm yolunu aktive eden ADR gibi stresörlere yanıt olarak apoptotik proteinleri (örneğin kaspaz-3) serbest bırakır ³⁴. Mitokondriyal disfonksiyonun ve apoptozun mitokondriyal fisyonu baskılayarak bloke edilmesi böbrek hasarları için potansiyel tedavinin anahtarı olabilir. Bu nedenle biz de çalışmamızda ALA ‘nın mitokondriyal fisyon üzerindeki etkisini test ettik. ALA ‘nın ADR ile artan DRP1 ekspresyonlarını azaltarak mitokondriyal fisyon inhibisyonu yoluyla mitokondriyal dinamikleri düzenlemede iyileştirici rol oynayabileceği kanısındayız. Ayrıca ADR grubunda böbrek dokularında apoptozda rol oynayan proapoptotik belirteçlerden olan CASP3 ve BAX mRNA ekspresyonundaki artış, apoptotik hücrelerdeki artışı destekleyen bir bulguydu. Bununla birlikte, ADR grubunda artan DRP1 ekspresyonları ile CASP3 ve BAX mRNA düzeylerindeki artışın paralellik göstermesi DRP1’in yukarıda bahsedilen apoptozu indükleyen ajan olduğu bilgilerini doğrular nitelikte olmuştur. Su ve arkadaşları ³⁵ ADR uygulamasıyla böbrek dokusundaki hücre hasarlarını, bozulan böbrek fonksiyonunu ve histolojisini CASP3 artışına ve CASP3’ü aktive eden ve programlanmış hücre ölümünü başlatan oksidatif stresin indüksiyonuna atfetmişlerdir. Çalışmamızdaki bulgular ADR kaynaklı böbrek dokularında gözlenen histopatolojik bulgular ile artan CASP3 ve BAX ekspresyon düzeyleri arasındaki bağlantı açısından daha önceki araştırmaların verileri ile uyumludur. Ayrıca, ALA tedavisiyle apoptotik CASP3 ve BAX mRNA seviyelerindeki azalma gözlendi. ALA uygulamasıyla histopatolojik bulgularda gözlenen iyileşmenin azalan CASP3, BAX ve DRP1 ekspresyon seviyelerinden kaynaklanabileceği kanısındayız.

Sonuç olarak, moleküler ve histopatolojik bulgularımıza göre ADR, DRP1, CASP3 ve BAX ekspresyonlarını arttırarak böbrek dokusunda ciddi doku harabiyetine neden olmuş ve ALA, mitokondriyal fisyon inhibisyonunda rol oynayarak ve antapoptotik özellikleri sayesinde güçlü bir serbest radikal süpürücü olarak ADR kaynaklı böbrek dokusu hasarını azaltmıştır. ALA’nın renal koruyucu etkisini, ADR grubundaki histopatolojik bulguların, DRP1 aktivitesinin ve apoptotik belirteçlerin restorasyonunu sağlayarak gerçekleştirdiği, bu sonuçlarımıza dayanarak da ALA uygulamasının terapötik etkinliği arttırmak ve klinik kemoterapide ADR'nin toksik yan etkilerini azaltmak için etkili bir rejim olabileceği kanısındayız. Bununla birlikte, sonuçlarımızı doğrulamak için daha fazla deneysel ve klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.

Finansman
Bu çalışma Fırat Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü, Elazığ, Türkiye [Proje numarası MAÜ. BAP. 18.SYO.010] tarafından desteklenmiştir.