Adli tıpta yaş tayini oldukça önemli bir konudur. Yaş; cinsiyet, boy, vücut agırlıgı, saç, cilt, göz rengi, parmak izi, kemik ve dişler gibi bireyin tıbbi kimligini oluşturan fiziksel yapılardan biridir.

Özellikle Adli tıpta cezai sorumluluk, hukuki ehliyet, farik ve mümeyyizlik, ahlaki readet fiili, ruhsal yönden mukavemet, askere alınma, memuriyete girme, okula başlama, emekli olma, sürücü belgesi alma gibi durumlarda kişinin yaş tespiti yasalara uygunluk açısından gündeme gelmektedir ¹. Bu konuda birçok yöntem bulunmakla birlikte küçük dokulardan yaş tayini yapabilmek, adli tabiplere büyük kolaylıklar getirebilecektir.

Tanı amacıyla neoplastik dokuların, nonneoplastik dokulardan veya benign lezyonların malign lezyonlardan ayrılmasında etkili bir yöntem olan AgNOR’un degişik yaş gruplarında lenfositlerde farklı sayıda NOR beneklerini boyaması nedeniyle ^2-6 farklı dokularda da yaş tayinine yardımcı olabilecegi düşünüldü.

Histopatologlar, hastalıkların etiyopatogenezinde rol alan unsurların etkisi sonucu, nükleus, DNA ve hücre kinetigine yönelik, DNA flow sitometri (DNA ploidi ve hücre proliferasyonu) hücre proliferasyon belirleyicisi olan Ki-67 monoklonal antikor çalışmaları ve DNA-RNA in situ hibridizasyon yöntemlerine, Nükleolar Organizasyon Bölgeleri (NOR) üzerindeki degişimlerin araştırılmasını eklediler. Bu çalışmalarda hiperplastik ve neoplastik durumlarda nükleolus ve nükleolar aktivasyonun belirlenmesinin yararlı oldugu düşünülmüştür ]].

Mc Clintock 1934’de karyotipte 2.darlık olarak gözledigi kısma “Nücleolar organizer regions” (NORs) adını vermiştir. NOR terimi nükleolün köken aldıgı bölgeyi tanımlamaktadır. Nükleolar Organizasyon Bölgeleri (NOR), ribozamal RNA’nın kodlandıgı kromozamal segmentlerdir. RNA polimeraz 1, B23 protein ve C23 proteinler gibi non-histon proteinlerle assosiye haldedirler. AgNOR boyama yönteminde özellikle non-histon komponentinin tepkimeye girdigi ortaya konmuştur ^2-8. NORs proteinleri, ribozamal DNA veya olası transkripsiyon düzeyinin göstergesi olarak görülmekte olup, AgNOR bölgelerinin gösterilmesinin hücre proliferasyon hızı, ploidi, transkripsiyonel aktivite ve tümörün malignite potansiyelinin degerlendirilmesi açısından yararlı olduguna dair (deri, meme, lenfoid doku, kadın genital sistem, mesane, GIS) yayınlar vardır ⁹.

Günümüzde çok yönlü sürdürülen çalışmalar, yaş tespiti için en uygun yöntemin araştırılması üzerine yogunlaşmıştır [

1999-2002 tarihleri arasında çeşitli nedenlerden dolayı farklı yaş grubunda exs olan 23 E, 15 K toplam 38 olgu çalışmaya alındı. Olguların geçmişinde herhangi bir tümoral hastalık hikayesi taşımadıgı yakınlarından ögrenildi. Yenidogan (0-12 ay) 4 (2E, 2K) olgu, infantil dönem (1-5 yaş) 11 (4E, 7K) olgu, adult dönem (25-35 yaş) 16 (13E, 3K) olgu ve yaşlı (50 yaş ve üzeri) 7 olgu (4E, 3K) olarak dört ayrı yaş grubu oluşturuldu.

AgNOR boyama yöntemi :
Olgulardan 1x1 cm ebadında abdominal cilt örnekleri alındı. Formaldehid (%10’luk) içinde fikse edildi. Toz jelatin, formik asit ve gümüş nitrat %70’lik alkol fiksasyonunda hazırlanmış parafin bloklardan 4 mikron kalınlıgında kesitler alındı. Kesitler etüv ve ksilende deparafinize edilip, sırasıyla alkol ve deiyonize sudan geçirilerek rehidrate edildi ¹².

Solüsyonlar:
100 ml deiyonize suya 1 gr/dl olacak şekilde formik asit eklendi. Bu karışım içine 2 gr jelatin katıldı. Hafif ısıtılarak, tamamen çözünmesi saglanıp, sogumaya bırakıldı. 50 gr/dl olacak şekilde gümüş nitrat, deiyonize su ile karıştırıldı. AgNOR solüsyonu yukarıda tanımlanan %2 toz jelatin içeren formik asit solüsyonundan 1 volüm, gümüş nitratlı solüsyondan 2 volüm, boyama sırasında karıştırılarak elde edildi. Uygun hacimlerde homojenize edilerek elde edilen solüsyonun, oda ısısında, karanlık ortamda, 35 dakika süre ile, önceden elde edilen preperatlar üzerindeki doku örneklerine damlatılarak uygulanması ile AgNOR boyama yöntemi gerçekleştirildi ¹².

Sonuç:
Cilt epidermisi çok katlı yassı epiteli malpigi tabakasındaki hücre nükleusları içinde yer alan NOR bölgeleri, siyah-kahverengi, diger tüm alanlarda zemin açık sarı renkte izlendi.

Sayma işlemi:
Tüm olgularda x100 immersiyon objektifinde, her nükleus için nükleolar membran ve granüler nükleolar matriksin net seçildigi ayar saptanarak, rastgele 100 hücre Howat’ın önerdigi şekilde sayıldı ¹². AgNOR sayımı yapıldıktan sonra, her olgunun ortalama AgNOR skoru ve standart sapması belirlendi. Istatiksel olarak yaş grubları arasında karşılaştırma yapıldı. Ayrıca cinsiyet ayırımına baglı anlamlı bir fark olup olmadıgı incelendi.

Verilerin istatistiksel karşılaştırmaları “SPSS 5.0 for windows” paket programı kullanılarak tespit edildi. Istatistiksel testler olarak da ki-kare ve Pearson korelasyonu kullanıldı.

Çalışmaya alınan tüm örnekler farklı yaş gruplarına göre ayrıldı. Tüm olgularda nükleus içndeki NOR benekleri, rastgele 100 hücre Howat’ın önerdigi şekilde sayıldı. Bu sayım sırasında benekçikler şekil ve boyut farklılıgı açısından da degerlendirildi. Yaş gruplarına göre tespit edilen ortalama AgNOR dagılım skoru belirlendi ve her yaş grubu için istatistiksel olarak anlamlı kabul edilebilir en düşük ve en yüksek sayısal degerler verildi. Yaş ortalaması arttıkça AgNOR boyama yöntemiyle azalan sayıda NOR benekleri boyanması tespit edildi (Şekil 1, 2, 3, 4).

Yenidoğan (0-12 ay) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (sayıca fazla ve iri görünümlü)

İnfant (1-5) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (sayıca fazla ve küçük görünümlü)

Adult (25-35) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (tek tek ve iri görünümlü)

Yaşlı (50 yaş ve üzeri) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (tek tek ve küçük görünümlü)

Yenidogan (0-12 ay) yaş grubunda NOR benekleri boyaması ortalama 2.15 olarak en yüksek oranda AgNOR dagılımı gösterdi. Bunu infant 1.89, adult 1.67 ve yaşlı yaş grubu 1.46 olmak üzere azalan ortalama degerleri ile izledi (Tablo 1).

Yaş Grubuna Bağlı AgNOR Ortalaması ve Değer Aralığı

Sonuç olarak tüm yaş gruplarında ortalama proliferatif indeks incelendiginde, en genç yaş grubundan en büyük yaş grubuna dogru azalan oranda AgNOR dagılımları skoru ile yaş grupları arasında anlamlı bir ilişki vardı (p<0.01). Bireylerin genç yaşlarda gelişme süreci içinde, hücrelerin hızlı proliferasyonu nedeni ile hücre bölünmesine katkıda bulunan NOR bölgelerinin arttıgı, yaşlı popülasyonda ise hücre bölünme sayı ve yeteneginin azalması ile NOR bölgelerinin azaldıgı tespit edilmiştir. Bu durum yaş tespitinin histolojik tanısında, önemli bir belirleyici olarak olarak degerlendirildi. Böylece AgNOR yöntemiyle postmortem insan epidermisinde yaşla dogru orantılı degişiklikler açıkça gösterildi. Ki-kare testi uygulandıgında her grup içinde ve genel ortalamaya bakıldıgında cinsiyet ayırımına baglı anlamlı bir fark saptanmadı.

Geçmişten günümüze kadar yapılan çeşitli çalışmalar ve morfolojik araştırmalar yaş tespitinde en dogru yaklaşımı bulmak için yapılmaktadır ^13,14. Epifiz, kemikleşme merkezleri ve kraniyal süturların kapanması, simfisiz pubisteki degişiklikler, kostaların kalsifikasyon gösteren sternal birleşme noktaları ve çeşitli biyokimyasal çalışmalar yaş tesbitinde tanımlayıcı tetkikler olarak uygulanmaktadır ^13-19. Bu çalışmada AgNOR yöntemi, kronolojik yaş tespitinde istisnai bir araştırma olarak yapılmıştır. Özellikle adli amaçlı yapılan çalışmalarda bu yöntem bireylerin yaş tespitinde alternatif bir metot olarak sunulmuştur. Böylece, rutinde kullanılan diger metotlarda yaşanan bazı güçlükler ve net olamayan veriler bu yöntem ile aşılmaya çalışılmıştır. Farklı yaş gruplarına ait 38 insan cildinden alınan örnekler AgNOR boyama yöntemi kullanılarak degerlendirilmiş ve sonuçları bu çalışmada sunulmuştur.

Tüm yaş grupları degerlendirildiginde yeni dogan (0-12 ay) yaş grubunun sayısal AgNOR dagılım skoru % 10.5 olarak tespit edildi. Bu deger, diger yaş grupları ile kıyaslandıgında anlamlı degerlendirilebilecek ölçüde yüksekti. Ki-Kare ve Korelasyon degerleri istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.01). Böylelikle, yaşa baglı degişikliklerin AgNOR boyama yöntemi ile tespit edilebilecegi görüldü. Bu çalışma ile, adli uygulamalarda karşılaşılan yaş tespiti vakalarında histokimyasal tanı yöntemi olarak AgNOR’un önemli bir alternatif yöntem olarak kullanılabilecegi gösterildi.

Butler ve arkadaşları ⁵, yaş ve cinsiyet arasında farklılık ve yaş ile AgNOR arasında negatif korelasyon olup olmadıgını bulmak için AgNOR’u kromozomlarda kullanmışlar; ancak bulunan bu korelasyon istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmemiştir. Yaptıgımız bu çalışmada ise, yaş ve AgNOR arasında anlamlı bir istatiksel karşılaştırma elde edilmiştir. Das, lenfositlerle yaptıgı çalışmada özellikle yenidogan kord kanından elde ettigi lenfositlerin AgNOR boyaması neticesinde tespit edilen NOR beneklerinin 9.49 oranı ile diger yaş gruplarına göre en yüksek sayısal ortalamayı verdigini göstermiştir ⁶. Bizim çalışmamızda da bu çalışmada elde edilen sonuçlarla uyumlu olarak benzer şekilde en genç yaş grubunu oluşturan yenidogan (0-12 ay) grubundan, en büyük yaş grubunu oluşturan yaşlı (50 yaş ve üzeri) grubuna dogru azalan oranda AgNOR dagılımı sayısal ortalaması tespit edilmiştir.

AgNOR boyama yöntemi kullanılarak yapılan birçok çalışmada kan ve kan ürünleri kullanılmıştır ^3-6. Bizim çalışmamızda kan örnegi elde edilemeyen, hatta bireyin kendisinin de olmadıgı durumlarda elde edilen veya delil olarak ele geçen deri gibi küçük doku parçalarına dahi yöntemin uygulanarak, yaş grubu hakkında yorum yapılabilmesi pratik uygulama için önemli bir avantaj ve gelişme olarak degerlendirilmiştir.

Bilindigi gibi adli uygulamalarda postmortem olguların ve özellikle kimlik tespiti yapılamayan bireylerin yaşlarının tespiti, araştırmalarla sınanmış ve etkinligi gösterilmiş yöntemlerin rutin kullanıma giremeyişi nedeniyle hala sorun olarak devam etmektedir. Kimlik tespiti yapılamayan postmortem olguların karın cildi örneklerinden AgNOR boyama yöntemi ile yaş tespiti kullanışlı bir metottur. Bu metot yaşayan olguların cilt biyopsilerine de kolaylıkla uygulanabilmektedir. Karın cildinin çok esnek olması sebebiyle, bu bölgeden alınan örnekler probleme sebep olmamaktadır. Oldukça güvenilir sonuçlar elde edilen bu metotun rutinde kullanılan diger yöntemlerle karşılaştırıldıgında gerekli ve yeterli ölçüde uygun ve kabul edilebilir bir yöntem olduguna dair veriler elde edilmiştir.

Insan derisinde AgNOR boyama yönteminin uygulanması, bireylerin yaş tespitinde kullanışlı bir araç ve alternatif bir metot niteliginde olabilecegi sonucuna varılmıştır. Özellikle küçük dokularda kullanılabilirligi nedeni ile geliştirmek ve yaygınlaştırmak üzere bir ön çalışma niteligindedir. Bu sonuçlar adli patolojide potansiyel uygulanabilirliginden dolayı ilgi çekicidir. Ancak insan yaşının belirlenmesinde daha iyi sonuçlar elde edilebilmesi için daha çok birey üzerinde ileri araştırmalar yapılmalıdır.