Gereç ve Yöntem: Çalışmada 8-10 haftalık 40 adet Sprague Dawley cinsi erkek sıçan kullanıldı. Deney hayvanları 4 eşit gruba ayrıldı. Kontrol grubuna deney süresince hiçbir uygulama yapılmadı. O3 grubuna deney süresince haftada 3 gün 150 μg/kg/gün ip O3 uygulandı. CCl4 grubuna deney süresince 2 mg/kg dozunda haftada 2 gün ip CCl4 uygulandı. CCl4+O3 grubuna deney süresince CCl4+O3 uygulandı. Deney sonunda sıçanlar dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından karaciğer dokuları hızla çıkarıldı ve histopatolojik azalizler için kullanıldı.

Bulgular: CCl4 maruziyeti TUNEL apoptotik indekste artışa ve histopatolojik değerlendirmelerde hepatosit hasarına neden olduğu görüldü. Antioksidan amaçlı verilen O3 uygulaması, kontrol grubuna göre anlamlı değişiklikler oluşturmadı. Fakat CCl4 maruziyeti olan gruptaki sıçanların karaciğerinde beklenenin aksine oksidan etkiye neden oldu.

Sonuç: O3’nun CCl4 toksikasyonuna karşı antioksidan kullanımıyla ilgili hem doz konsantrasyon farklılığı hem de sayı başta olmak üzere daha fazla çalışmaya gerek duyulmaktadır.

CCl₄’ün yıkımı sonucu açığa çıkan reaktif bileşikler hedef moleküllere bağlanır, bu moleküller de primer ya da sekonder ilişki yoluyla lipid peroksidasyon, reaktif oksijen türleri (ROT) oluşumu, GSH/GSSG oranında değişiklikler oluşturup toksisite meydana getirir ⁶. CCl₄ maruziyetinin devamlılığı, serbest radikallerin salınımı aracılığıyla karaciğer dokusunda toksisite oluşturmaktadır. Karaciğerdeki toksisite sonucunda histopatolojik olarak balonlaşma dejenerasyonu, komşu hepatosit yağ başkalaşımı, hücre iltihabı, santral ven etrafına lokalize lenfosit ve Kupffer hücre infiltrasyonu ve nekroz gözlenir. Kupffer hücreleri; proinflamatuar sitokin, tümor nekrozis faktör-α (TNF-α) ve interlökin 1h (IL-1h) üretimine neden olur. Ve bu sürecin devamlılığı sonucunda karaciğerde fibrozis ve siroz oluşabilir. Literatürde yer alan çalışmaların çoğunda, artan oksidatif stres ile karaciğer fibrozisi arasındaki ilişki gösterilmiştir ^7-9. Lipid peroksidasyonu, lipoprotein sentezinde gerekli olan yapıları da hasara uğratarak karaciğerde lipidozise katkıda bulunur. Aşırı lipit birikimi karaciğerde işlevsel bozukluğa sebep olur, bu da siroza doğru ilerleyen değişimler ortaya çıkarır ^7,8. CCl₄’e bağlı karaciğer hasarının gelişim basamakları; redüktif dehalojenasyon, radikallerin kovalent bağlanması, protein sentezinin inhibisyonu, yağ birikimi, kalsiyum sekestrasyonunda kayıp, apoptozis ve fibrozis şeklin-dedir ¹⁰.

Ozon (O₃), “ozein” (koku yayan) kelimesinden türetil-miş, gaz halinde bulunan ve üç oksijen atomundan oluşan bir moleküldür. O₃ gazı yeryüzünden 20-50 km yükseklikte ozonosfer tabakasında bulunur ve UV dalgalarını (260-280 nm) absorbe eder. O₃ yoğunluğu biyolojik denge açısından önemlidir ve ozonosferin tahrip olması güneşin zararlı UV ışınlarına maruziyeti arttırmaktadır ¹¹. O₃’nun ilk kullanımı dezenfektan ve antibakteriyel etkisi ile olmuştur. O₃; virüs ve bakterileri öldürür, mikroorganizmaları ve toksinlerini oksi-de eder, pestisitleri, fenolleri, kimyasal atıkları, aromatik bileşikleri ve deterjanları etkili bir şekilde nötralize edebilir ^12,13. O₃ ilk olarak çoklu doymamış yağ asidi (ÇDYA) ile ve daha sonra antioksidanlar (ürik asit, askorbik asit vb), –SH grupları içeren tiyol bileşikleri (sistein gibi), redükte glutatyon ve albuminle reak-siyona girer ¹⁴. Reaksiyonlar sonucunda O₃’nun hücre seviyesindeki etkileri, ROT ve lipid oksidasyon ürünleri (LOÜ) aracılığıyla olur. ROT plazmada çok süratli oluşur ve antioksidan kapasitede %5-25 kadar azalma meydana gelir, sonrasında 15-20 dakika içerisinde bu etki geri döner ¹⁵. ROT’un yarılanma süresi çok kısa olduğu için, henüz kan hastaya geri verilmeden önce ortadan kalkarak yerlerini LOÜ’ye bırakır. LOÜ daha kararlıdır. Bir kısmı idrarla ve safra ile atılırken bir kısmı da glutatyon transferaz (GSH-transferaz) ve aldehid dehidrogenaz yolağı ile metabo-lize edilir. Mikromolar konsantrasyonda geriye kalanlar ise vücutta devam eden oksidatif stresin haberci molekülleri olarak vücuda yayılırlar. Bu yayılım sonucunda vücuttaki glutatyon redüktaz (GSH-redüktaz), glutatyon peroksidaz (GSH-peroksidaz), süperoksit dismutaz ve katalaz gibi antioksidan enzim üretiminde artış olur ¹⁶. O₃’nun dokularda gösterdiği etkiler; eritrositlerde glukoz 6 fosfat dehidrogenaz seviyesinde yükselme, glikolizde ve ATP miktarında artış, hücre içi pH’ta düşme, 2,3 difosfogliserat miktarında yükselme sonucu oksijen disosiasyon eğrisinde sağa kayma, dolayısıyla dokulara oksijen verilmesinde ve arteryel oksijen basıncında artış; endotel hücrelerinden nitrik oksit (NO) ve karbonmonoksit salınımında artış ve prostasiklin indüksiyonuyla vazodilatasyon gelişmesi; plateletlerde hidrojen peroksit (H₂O₂) artışı nedeniyle agregasyonda ve growth faktör üretiminde ve trombosit fonksiyonlarında artış, aktive olan trombositlerde bulunan büyüme faktörleri ve inflamatuar sitokinlerin (PDGF-β, TGF-β, IL-8 ve EGF) salımını ile iskemi ve ülserli hastalarda iyileşmeye olumlu etki; immün sistem hücrelerinde nötrofillerin fagositik aktivitelerinde artış, H₂O₂ artışı, tirozin kinaz aktivasyonuyla proinflamatuar süreci hızlandırması ve sitokin salınımını indüklemesidir ^17-20. Yine H₂O₂ artışına bağlı inter-feronlar, interlökinler, tümör nekroz faktör, transforme edici büyüme faktör, granülosit-makrofaj koloni stimülan faktörü artışı meydana gelir. Retiküloendotelyal sistemi stimüle ederek dokuların tamir mekanizmasını destekler ^13,21. O₃’nun oksidatif etkisi nedeniyle doz ayarlaması çok önemlidir. Terapötik doz aralığı 10-80 μg/ml olup bu doz aralığındaki uygulamalarda herhangi bir yan etki oluşmamaktadır. Düşük dozlarda terapötik etki ortaya çıkmazken, doz aşımında güçlü bir oksidan olarak toksik etki gösterir ¹⁸. Terapötik dozda verildiğinde vücutta oluşturulan şey aslında kontrollü bir oksidatif strestir. Fizyolojik seviyede oksidatif stresin nörohumoral mekanizma ile yararlı olduğu bildirilmektedir.

CCl₄ Uygulaması: Ratlar canlı ağırlıkları birbirine yakın olacak şekilde gruplara ayrıldıktan sonra dört hafta boyunca 2 ml/kg dozunda CCl₄ 1/3 oranında zeytinyağı ile homojen karışım halinde hazırlandıktan sonra 2 mg/kg dozunda deneklere uygulandı ^22,23.

Sıçanlar havalandırma şartlarının uygun olduğu bir mekanda özellikli hazırlanmış kafeslerde (3’lü-4’lü gruplar halinde) barındırıldı. Deney hayvanlarının yem ve suyu özel hazırlanmış çelik içerikli ürünlerde verildi. Denekler Yem Sanayi T.A.Ş. Elazığ Yem Fabrikasında hazırlanan pelet halindeki sıçan yemi ile beslendi. Denekler standart rat yemi ve çeşme suyu ile ad libitum olarak beslendi. Sıçanların deney öncesi ve deney süresince bakımlarına bu şekilde devam edildi.

Deney sonunda 4 grupta yer alan sıçanların hepsi ketamin (75 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) ip uygulanarak anestezi altında sakrifiye edilerek çalışma sonlandırıldı. Sonrasında sıçanların karaciğer dokuları hızlı bir şekilde çıkarıldı. Çıkarılan karaciğer dokuları histolojik incelemeler için bouin solüsyonunda tespit edildi.

Ozonun Elde Edilmesi
Ozon (O 2 /O 3 karışımı), tıbbi sınıf oksijenden ozonatör ekipmanı ile Humazona cihazından (Humares, Almanya) üretildi, ozon konsantrasyonu 254 nm'de bir UV spektrofotometresi kullanılarak ölçüldü. Elde edilen ozon gazı oksijenozon karışımı olup %95 oksijen ve %5 ozon içermekteydi.

Terminal Deoksinükleotidil Transferaz dUTP Nick Uç Etiketleme (TUNEL)
Parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler elde edilip polilizinli lamlara alındı. Üretici firmanın talimatları doğrultusunda ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, cat no: S7101, USA) kullanıldı ve apoptozise giden hücreler belirlendi. Hazırlanan preparatlar araştırma mikroskobunda (Olympus BH–2) incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı. TUNEL boyamanın değerlendirilmesinde Harris hematoksilen ile maviye boyanan çekirdekler normal, kahverengi nükleer boyanan hücreler apoptotik olarak değerlendirildi.

Histokimyasal Boyama
Sıçanların karaciğer dokuları %10’luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi ve ardından musluk suyu altında yıkandı. Yıkanan dokular rutin histolojik takip serilerinden geçirilerek dehidrate edildi. Dehidratasyondan sonra ksilolde parlatılıp parafine (P3558, Sigma-Aldrich, ABD) gömüldü. Rodajlı ve polilizinli lamlara, hazırlanan parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Preparatlar Hematoksilen- Eozin (H&E) boyası ile boyandı. Işık mikroskobunda (DM2500 LED, Leica, Almanya) incelenip fotoğraflandı (MC170 HD, Leica, Almanya).

İstatistiksel Analiz
Veriler ortalama ± SEM değerleri olarak sunuldu. p <0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi. Verilerin normal dağılımının varsayıma uygunluğu Shapiro Wilk testi uygulanarak incelendi ve test sonucunda verilerin normal bir dağılım gösterdiği tespit edildi. Buna istinaden normal dağılım gösteren grupların birbiri ile karşılaştırılarak aralarındaki farklılıkların tespiti için Tek Yönlü Varyans (ANOVA) Analizi uygulandı ve ikili karşılaştırmalar için de posthoc Duncan testi kullanıldı. Tüm istatiki analizler SPSS (Statistical Package for Social Sciences) versiyon 15.0 paket programı kullanılarak yapıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: TUNEL bulguları, A: kontrol grubu, B: O3 grubu, C: CCl4 grubu, D: CCL4+ O3 grubu.

Histolojik Bulgular
H&E, PAS ve Masson Trikom histolojik boyama metodları uygulandıktan sonra deney hayvanlarının karaciğer dokularından histolojik görüntüler elde edildi. Pozitif kontrol grubuna ait doku kesitlerde hafif sinüzoidal dilatasyon ve vasküler konjesyon (PAS ve H&E boyama ile) tespit edildi. CCl₄ grubuna ait doku kesitlerinde portal alanda, V. centralis ve sinozoidler arasında mononükleer hücrelerde artış ve az sayıda hepatositte mikroveziküler yağlanma (PAS, H&E ve Masson Trikom boyama ile) saptandı. CCl₄ + O₃ grubuna ait doku kesitlerinde glikojenini kaybetmiş hepatositler, central dizilimde bozulma, vasküler konjesyon, belirgin sinüzoidal dilatasyon, heterokromatik ve piknotik çekirdekli hepatositler (PAS, H&E ve Masson Trikom boyama ile) tespit edildi (Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: H&E, PAS ve Masson Trikom histopatolojik boyama bulguları, A: Negatif kontrol grubuna ait kesit. Normal histolojik görünümlü hepatositler (kırmızı ok) ve Vena sentralis (V.S), hafif vasküler konjesyon (siyah yıldız). H&E x20. B: Pozitif kontrol grubuna ait kesit. Hafif sinüzoidal dilatasyon (çentikli siyah ok). Pas x20. C: Pozitif kontrol grubuna ait kesit. Vasküler konjesyon (siyah yıldız), Hafif sinüzoidal dilatasyon (çentikli siyah ok). H&E x20. D: CCI4 grubuna ait kesit. Portal alanda mononükleer hücrelerde artış(siyah üçgen). Masson x20. E: CCI4 grubuna ait kesit. Az sayıda hepatositte mikroveziküler yağlanma ve mononükleer hücre artışı(eğri siyah ok). Pas x20. F: CCI4 grubuna ait kesit. V. centralis ve sinozoidler arasında mononükleer hücre infiltrasyonu (çok yönlü siyah ok). H&E x10. G: CCI4 + O3 grubuna ait kesit. Glikojenini kaybetmiş hepatositler (siyah ok), central dizilimde bozulma, damarda konjesyon (kalın siyah ok). Masson x20. H: CCI4 + O3 grubuna ait kesit. Bazı alanlarda glikojen içeriği boşalmış hepatositler (siyah ok). Heterokromatik ve piknotik çekirdekli hepatositler (siyah ok başı). Pas x20. I: CCI4+O3 grubuna ait kesit. Belirgin sinüzoidal dilatasyon (çentikli siyah ok), vasküler konjesyon (siyah yıldız). H&E x20.

Yapılan deneysel araştırmalarda CCl₄ maruziyetinin karaciğerde; hepatosit dejenerasyonunda ve TUNEL ile boyanan apoptotik hücre sayısında önemli artışa, dağınık nekroz alanlarına, belirgin hepatosit ödemine, hücresel sınır kaybı oluşumuna, hepatik yapıda bozulmaya, lobüller boyunca yağ birikimine, hücresel vakuolizasyonun yanı sıra sinüzoidal endotelde fokal bozulmaya, Disse boşluklarında genişlemeye ve portal alanda mononükleer inflamatuar hücre infiltrasyonuna neden olduğu rapor edilmiştir ^26-28.

Bu çalışmada da literatürle benzer şekilde CCl₄‘e maruz kalan sıçanların TUNEL ile boyanan apoptotik hücre sayısında istatistiksel olarak anlamlı olmasa da artış meydana geldi. Bunun yanında mikroveziküler yağlanma, hem portal alanda hem de v. centralis ve sinüzoidler arasında mononükleer hücre sayısında artış şeklinde hepatik yapıda bozulmalar saptandı.

Yapılan bu çalışmada hafif vasküler konjesyon ve hafif sinüzoidal dilatasyon şeklinde minimal hepatik değişiklikleri gözlemlendi. Elde edilen veriler literatür çalışmaları ile benzerdi ²⁹.

Yapılan bu çalışmada CCl₄+O₃ uygulanan gruptaki sıçanların karaciğer dokularında TUNEL pozitifliğinin anlamlı derece arttığı ve histopatolojik görüntülemelerde diğer boyama yöntemleriyle glikojenini kaybetmiş hepatosit, vasküler konjesyon, central dizilimde bozulma ve belirgin sinüzoidal dilatasyon bulguları elde edildi. Çalışma sonucunda O₃’ün beklenen oksidan etkiye sahip olmadığı kanaatine varılmıştır. CCl₄ intoksikasyonunda O₃ uygulamasının hepatik hasar talosunu daha da dramatize etmiş olması nedeniyle O₃ uygulamalarında doz çalışmalarına ve etki mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik yeni araştırma planlamalarına ihtiyaç olduğu anlaşılmıştır.

1) Doğan A. Farmakoloji. Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Ders Kitapları, Kars. 2000.

2) National Academies Press, 1995.

3) Kumar V, Abbas A, Fausto N. Pathologic Basis of Disease. 7nd Ed, China: Elsevier Saunders, 2005: 1525.

4) Thrall KD, Vucelick ME, Gies RA et al. Comparative Metabolism of 113 Carbon Tetrachloride İi Rats, Mice, and Hamsters Using Gas Uptake and PBPK Modeling. J Toxicol Environ Health A 2000; 60: 531-48.

5) Basu S. Carbon Tetrachloride-induced Lipid Peroxidation: Eiocosanoid Formation and Their Regulation by Antioxidant Nutrients. Toxicology 2003; 189: 113-27.

6) Weber LW, Boll M, Stampfl A. Hepatotoxicity and Mechanism of Action Ofhaloalkanes: Carbon Tetrachloride as a Toxicological Model. Critical Reviews in Toxicology 2003; 33: 105-36.

7) Güven A, Güven A, Gülmez M. The effect of Kefir on the Activities of GSHPx, GST, CAT, GSH and LPO Levels in Carbon Tetrachloride-İnduced Mice Tissues. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2003; 50: 412-6.

8) Oh WY, Pyo S, Lee KR et al. Effect of Holotrichia Diomphalia Larvae on Liver Fibrosis and Hepatotoxicity in Rats. J Ethnopharma 2003; 87: 175-80.

9) Wang H, Wei W, Wang NP. Melatonin Ameliorates Carbontetrachloride İnduced Hepatic Fibrogenesis in Rats via İnhibition of Oxidative Stres. Life Sciences 2005; 77: 1902-15.

10) Boll M, Weber L, Becker E, Stampfl A. Mechanism of Carbon Tetrachloride İnduced Hepato-toxicity. Hepatocellular Damage by Reactive Carbon Tetrachloride Metabolites. Z Naturforsch 2001; 560: 649-59.

11) Viebahn-Haensler R. The Use of Ozone in Medicine. 5. Ed, İffezheim, Germany: Odrei Publishers, 2007: 14-48.

12) Beck EG, Wasser G, Viebahn-Hansler R. The Current Status of Ozone Therapy Empirical Developments and Basic Research. Forsch Komplemen-tarmed 1989; 5: 61-75.

13) Bocci VA. Scientific and Medical Aspects of Ozone Therapy. State of the art. Arch Med Res 2006; 37: 425-35.

14) Hernandez FA. To What Extent Does Ozone Therapy Need a Real Biochemical Control System? Assessment and İmportance of Oxidative Stress. Arch Med Res. 2007; 38: 571-8.

15) Rice-Evans C, Miller NJ. Total antioxidant status in plasma and body fluids. Methods Enzymol. 1994; 234: 279-93.

16) Snyder SH, Baranano DE. Heme Oxygenase: a font of Multiple Messengers. Neuropsychopharmacology 2001; 25: 294-8.

17) Bocci V, Luzzi E, Conradeschi F et al. Studies on the Biological Effects of Ozone. 4. Cytokine Production and Glutathion Levels in Erythrocytes. J Biol Regul Homeost Agents 1993; 7: 133-8.

18) Travagli V, Zanardi I, Silvietti A, Bocci V. A Physicochemical İnvestigation on the Effects of Ozone on Blood. Int J Biol Macromol 2007; 41: 5; 504-11.

19) Bocci V, Biological snd Clinical Effects of Ozone. Has Ozone Therapy a Future in Medicine? Br J Biomed Sci 1999; 56: 270-9.

20) Volkhovskaya NB, Tkachenko SB, Belopolsky AA. Modulation of Phagocytic Activity of Blood Polynuclear Leukocytes with Ozonized Physiological Saline. Bull Exp Biol Med. 2008; 146: 559-61.

21) Viebahn-Hänsler R. The Use of Ozone in Medicine: Mechanisms of Action. Munich 2003: 5; 23-5.

22) Shaker E, Mahmoud H, Mnaa S. Silymarin, the Antioxidant Component, and Silybum Marianum Extracts Prevent Liver Damage, Food and Chemical Toxicology 2010; 48: 803-6.

23) Bahçecioğlu ĠH, Koca SS, Poyrazoğlu OK et al. Hepatoprotective Effect of Infliximab, and Anti-TNF-α Agent, on Carbon Tetrachloride-Induced Hepatic Fibrosis, Inflammation 2008; 31: 215-21.

24) Çetinkaya A. Ratlarda N-asetil Sistein ve L-karnitin’in Karbon Tetraklorür ile Oluşturulan Akut Karaciğer Hasarı Üzerine Etkileri (Yan Dal Uzmanlık Tezi). Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı, Kahramanmaraş, Türkiye. 2009.

25) Hong RT, Xu JM, Mei Q. Melatonin Ameliorates Experimental Hepatic Fibrosisinduced by Carbon Tetrachloride in Rats. World J Gastroenterol. 2009; 15: 1452-8.

26) Chen X, Meng Q, Wang C et al. Protective Effects of Calycosin Against CCl4-İnduced Liver İnjury with Activation of FXR and STAT3 in Mice. Pharm Res. 2015; 32: 538-48.

27) Li S, Liu J, Zhang M, Chen Y, Zhu T, Wang J. Protective Effect of Eckol Against Acute Hepatic Injury Induced by Carbon Tetrachloride in Mice. Mar Drugs 2018; 16: 300.

28) Eidi A, Mortazavi P, Behzadi K, Rohani AH, Safi S. Hepatoprotective Effect of Manganese Chloride Against CCl4-induced Liver İnjury in Rats. Biol Trace Elem Res. 2013; 155: 267-75.

29) Güvendi GF, Eroğlu HA, Mustafa Makav, Güvendi B, Adalı Y. Selenium or Ozone: Effects on Liver İnjury Caused by Experimental İron Overload. Life Sci 2020; 262: 118558.