Bruselloz, tanısı zor olan enfeksiyonlardan biri olma özelliğini halen devam ettirmektedir. Hastalığın neden olduğu tanısal sorunlar, klinik değerlendirme aşamasından itibaren başlamaktadır
8. Kan kültürü; uygulama kolaylığı ve olası başka etkenleri de ortaya koyması nedeniyle en fazla kullanılan yöntem olmuştur. Ancak, hastanın bakteriyemik olmadığı bir dönemde numune alınması, etkenin çoğunlukla hücre içi yerleşimi ve bakterinin yavaş üreme hızı nedeniyle kan kültürü hastaların çok az bir kısmında pozitif sonuçlanmaktadır. Bu nedenle, rutin klinik tanıda hasta kanında Brucella spp.’ye karşı gelişen antikorların saptandığı indirekt tanı metotlarından serolojik testler en fazla kullanılan yöntemler olmuştur. Ancak bu testlerin, en az bir gün sürmesi, hastanın serumunda bulunan antikorların özelliği ve kullanıcı hataları nedeniyle sıkça yanlış negatif olarak sonuçlanmaktadır. Dolayısı ile brusellozun laboratuvar tanısında standardize edilmiş, hızlı sonuç verebilen, yüksek duyarlık ve özgüllükle çalışan yeni test metotlarına gereksinim devam etmektedir
9.
Brusellozun laboratuvar tanısında PCR’ın kullanımı gittikçe artmış ve gelecek adına ümit vadeden bir yöntem olma özelliği kazanmıştır. Ancak, PCR’ın bruselloz tanısındaki etkinliği hakkında hem sınırlı sayıda çalışma bulunmakta hem de yapılan çalışmalarda oldukça değişken aralıklarda tanısal performans değerleri bildirilmektedir. Dolayısı ile brusellozun endemik olarak bulunduğu bölgemizde PCR yönteminin tanı etkinliğinin saptanması, patojenin tür ayrımının yapılması ve taşıdığı önemli virülans genlerinin varlığının araştırılması hem klinik tanı yöntemlerinin yeniden gözden geçirilmesi hem de mevcut bilimsel bilgiye katkı yapma potansiyeli nedeniyle önemlidir.
Ülkemizde yapılan çalışmalarda; Kuyumcu’nun 2017 yılında İstanbul’da çalışmada, bruselloz tanısında serolojik testlerin etkinliği karşılaştırılmış ve bruselloz tanısı alan 12 hastadan dördünün (%33) kan kültürü pozitif saptanmıştır 10. Çalık ve Gökengin’in yaptığı ve 1990-2009 tarihleri arasında Türkiye’de yapılan bruselloz çalışmalarının incelendiği derlemede 4209 hastanın 1019’unun kan kültürü pozitif bulunmuş ve kan kültürünün hastaların ancak %24’ünü saptadığı bildirilmiştir 11. Çeken ve arkadaşlarının 12 akut bruselloz tanısında PCR testinin etkinliğinin araştırıldığı çalışmalarında 35 hastanın 16’sında (%45) kan kültürü pozitif saptanmıştır. Yaptığımız bu çalışmada ise Rose-Bengal testi pozitif olan 60 hasta arasında akut hastalık veya relaps tanısı alan 32 hastanın dokuzunda (%28.1) kan kültürü pozitif bulunmuştur. Kan kültürü yönteminin duyarlılığının düşük olması ve etkeni saptamak için geçen sürenin uzun olması nedeniyle brusellozun laboratuvar tanısında serolojik testler önemli bir yer tutmakta ve rutin tanıda daha sık kullanılmaktadır 13.
Brusellozun serolojik tanısında en fazla kullanılan testlerden birisi STA testidir. Bu testte, 1/160 ve üzeri titreler aktif enfeksiyonu gösterse de özellikle endemik bölgelerde geçirilmiş enfeksiyon olasılığı da göz önüne alınıp hastanın klinik bulguları da birlikte değerlendirilmesi gerektiği önerilmektedir 14. Tansel ve arkadaşlarının 15 Trakya Bölgesinde yaptıkları bir çalışmada, STA testinin duyarlılığı %87.5 olarak saptanmıştır. Serum Tüp Aglütinasyon testi çok sık kullanılan bir yöntem olmasına rağmen; blokan antikorlarının varlığı bruselloz tanısını güçleştirmektedir. Blokan antikorlar nedeni ile STA testi göz ardı edilmeyecek oranda yanlış negatif sonuçlar verebilmektedir. Kan kültüründen sonuç almanın uzun sürmesi ve duyarlılığının düşük olması, serolojik testlerde yaşanan çapraz reaksiyonlar, yalancı negatiflik, hastalığın tedavisinden sonra da kanda antikor varlığının olması, postzon ve prozon olaylarının gerçekleşme olasılığı gibi olumsuz durumlar nedeniyle son yıllarda bruselloz tanısında PCR gibi moleküler yöntemler kullanılmaya başlanmıştır 14,16.
Bu çalışmada üç aşamada PCR metodu kullanılmıştır. Bunlar; Brucella spp. DNA’sının hasta serumunda saptanması, PCR ile pozitif olarak saptanan numunelerde etkenin hangi tür olduğunun belirlenmesi, pozitif örneklerde altı adet virülans geninin varlığının araştırılmasıdır.
Uluslararası literatürde bruselloz tanısında PCR’ın etkinliğinin gösterildiği az sayıda çalışma olmakla birlikte testin etkinliğinin çok daha yüksek saptandığı sonuçlar bulunmaktadır. Elfaki ve arkadaşlarının 18 bruselloz hastalarına ait serum örneklerinde etken DNA’sının saptanmasına yönelik PCR testinin kullanılması ile ilgili yaptıkları çalışmada bruselloz semptomları olan 25 akut hasta değerlendirmeye alınmıştır. Standart tüp aglütinasyon testinin duyarlılığı %84 ve PCR testinin duyarlılığı ise %96 olarak bulunmuştur. Colmenero ve arkadaşlarının 19 2005 yılında yaptıkları çalışmada ise İspanya’da nörobruselloz tanısı alan 6 hastada SYBR Green I tabanlı real-time PCR testinin etkinliği araştırılmış; STA testinin duyarlılığı %66.6, kültür duyarlılığı %33.3 ve PCR testinin duyarlılığı ise %100 olarak bulunmuştur. Mitka ve arkadaşlarının 20 2007 yılında yaptıkları çalışmada, akut bruselloz ve relapslarda PCR testi diğer konvansiyonel yöntemler ile karşılaştırılmıştır. Çalışma için bruselloz teşhisi konan 200 hastadan toplam 4926 örnek toplanmıştır. Bunların 1642’si periferik tam kan örneği, 1642’si buffy coat ve 1642’si de serum örnekleri olup PCR testi için dört farklı primer kullanılmıştır. Bu çalışmada PCR testinin duyarlılığı tam kan, buffy coat ve serum örneklerinde sırasıyla %95.5 ile %100, özgüllüğü %100, PPD %100, NPD ise %93.5 ile %100 arasında bulunmuştur 20. Baddour ve Alkhalifa’nın 21 yaptığı çalışmada, insanda periferik kanda Brucella spp. DNA’sının tespiti için üç farklı PCR tekniği kullanılmıştır. PCR testinin özgüllüğü üç testte de %100 olarak bulunmuş, duyarlılıkları ise sırası ile %53.1, %88.4 ve %98 olarak tespit edilmiştir. Li ve arkadaşlarının 21 2018 yılında yaptıkları çalışmada, Pekin’de bir hastanede bruselloz spondilit tanısı alan 31 hastaya ait doku örneklerinde real-time PCR testinin tanı etkinliği araştırılmıştır. Çalışmada STA testinin duyarlılığı %80.6, özgüllüğü %100, PPD %100, NPD ise %76.9 olarak bulunmuştur. Real-Time PCR testinin duyarlılığı ise %93.5, özgüllüğü %100, PPD %100, NPD ise %90.9 olarak saptanmıştır 22.
Yaptığımız bu çalışmada ise geçirilmiş enfeksiyon ve takipli hastalar çıkarıldıktan sonra geri kalan 32 hastanın 19’unun (%59.2) serum örneklerinde real-time PCR yöntemi ile etkenin DNA’sı saptanmıştır. Kullanılan PCR testinin özgüllüğü ve PPD’i %100; NPD’i ise %87.1 olarak bulunmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlarda duyarlılık düzeyi uluslarası literatür bilgilerine yakın fakat göreceli olarak düşük bulunmuştur. Bu durumun olası nedenleri olarak bazı faktörler dikkat çekmiştir. Hasta numunesi olarak çalışmamızda serolojik testler için laboratuvara gönderilen ve ateşli dönem takibi yapılmadan alınan serum örnekleri kullanılmıştır. Ayrıca, yapılan çalışmalarda bruselloziste kanda bulunan ve bakteriyemiye neden Brucella spp. yükünün oldukça düşük olduğu bildirilmektedir 23. Brusella, hücre içi yerleşen bir etken olduğundan kanda daha çok fagositik hücreler içine yoğunlaşmaktadır. Ayrıca, bakterinin kanda bulunan DNA’sının saf olarak izole edilmesinde kullanılan yöntem ve ticari kitlere göre önemli farklılıklar oluşmaktadır. Dolayısıyla, bazı çalışmalarda bildiriliği üzere tam kan kullanılması veya Brucella spp. DNA’sını daha iyi düzeyde özütleyen ticari ekstraksiyon kitlerinin kullanılması testin etkinliğini arttırabilecek bir husus olarak görülebilir 24. Ancak yine de hastadan tek numune alınarak tanıya gidilmesinde ve PCR’ın serum etkinliğinin gösterilmesi yönünden elde ettiğimiz sonuç önemlidir. Test için hastadan ateşli dönemde veya ateş yükselmesi öncesi dönemde numune alınması kandaki bakteri sayısı arttığı için önemli olup bu durumda hasta kanındaki etken DNA’sı daha bol bulunmaktadır. Bu çalışmada kullanılan real-time PCR kitinin test saptama limiti >103 KOB/ml olduğu için bu düzeyin altındaki bakteriyemilerde testin yanlış negatif sonuçlanmış olması da olasıdır. Dolayısı ile daha hassas real-time PCR kitlerinin geliştirilmesi ile olası yanlış negatiflikler önlenebilecektir.
Brusella türlerinin bu güne kadar belirlenen en önemli virülans genleri omp19, wbkA, manA, mviN, üre ve perA olup çalışmamızda da bu genler araştırılmıştır. Bu genler tarafından kodlanan faktörler bakterinin enfeksiyon patogenezine, doku yayılımına ve optimal olmayan koşullarda hayatta kalma özelliğine katkı sunan etkiler sağlamaktadır. Çalışmaya alınan ve Brucella spp. DNA’sı saptanan tüm örneklerde çalışılan bu altı virülans geninin hepsi pozitif bulunmuştur. Bu sonuç, ilimiz ve bölgemizdeki suşların önemli virülans özelliklerini taşıdığının bir göstergesi olmuştur. Mirnejad ve arkadaşlarının 25 çalışmasında İran’ın farklı bölgelerinden izole edilen B. melitensis ve B. abortus suşlarında bulunan virülans faktörleri moleküler yöntemler ile araştırılmış ve multipleks PCR yöntemi ile manA %100, mviN %94.9, omp19 %93.6, perA %92.3, wbkA %89.7 ve üre %74.4 oranında tespit edilmiştir. Rahdar ve arkadaşlarının 7 yine İran’da yaptığı çalışmada sinovyal sıvı örneklerinden bruselloz etkeni ve bunlarda bulunan virülans genlerinin çeşitliliği multipleks PCR yöntemi ile araştırılmış ve virB, omp31, cbg, zhuA ve manA geni B. melitensis suşlarının hepsinde (%100) saptanmıştır. Brucella abortus suşlarında ise zhuA virülans geni %60, manA geni ise %80 oranında tespit edilmiştir. Yapmış olduğumuz bu çalışma ülkemizde saptanan B. melitensis suşlarındaki virülans genleri hakkındaki yayınlanmış olan çok az düzeydeki veriye önemli katkı sağlayacaktır.
)
)