Gereç ve Yöntem: β-glukoserebrozidaza spesifik poliklonal antikor Anti-GBA 3 bağlayıcı antikor olarak seçildi, Sandwiç ELISA metodu ile 12,5-400 ng/mL konsantrasyon aralığında β-Glucosidase enzimi standart olarak kullanıldı. Üzerine Antikor-enzim-inorganik hibrit konjugat ilave edilerek, test görünür hale getirildi. Böylece örnekteki ß-Glucosidase düzeyi oluşturulan kombinasyon ile yakalanabilmiştir.

Bulgular: Geleneksel sandwiç ELISA yönteminde Anti-GBA 1 konjugatı yüksek yanıt verirken hibrit sistemde Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugat daha yüksek yanıt vermiştir. Klasik yöntem için Lineer analitik performans R² >0.99 ve LOQ değeri 10 ng/mL olarak belirlenirken hibrit konjugat sisteminde ise R² >0.99 ve LOQ değeri 12,5 ng/mL olarak belirlenmiştir.

Sonuç: Geleneksel ELISA yöntemi ile karşılaştırıldığında, hibrit sistem HRP enziminin konjugata tek aşamalı olarak bağlanmasını sağlar ve sonuçta ortaya çıkan konjugat yapısının yüksek yakalama yeteneği ve katalitik aktivite kazandığını gösterir.

Oluşan kusurlar endozomal veya lizozomal sistem içinde biriken spesifik makromoleküllerin tamamen bozulmasını ve geri dönüşümünü önler, sonuç olarak, bozulmamış veya kısmen bozulmuş makromoleküller (proteinler, polisakkaritler, lipitler, vb.) çeşitli lizozom-larda aşamalı olarak birikir¹. Bu durum hücre geniş-lemesine yol açarak; normal hücre fonksiyonlarının bozulmasına ve sonuçta, hücre ölümü, merkezi sinir sistemi dahil olmak üzere yaygın olarak birden fazla organı ve dokuyu etkileyen ilerleyici Tay-Sachs, Gauc-her, Fabry, Metakromatik lökodistrofi, Krabbe, Nie-mann-Pick, vb gibi sistemik bir hastalıklara neden olur⁴. Gaucher hastalığı; sfingolipidoz sınıfından hastalıklardır, genellikle otozomal resesif bir şekilde aktarılırlar⁵. β-glukoserebrozidaz (GBA) enzim eksikliği ile karakterize, 1:100000 görülme sıklığına sahip karaciğer, dalak, akciğer gibi bazı organlarda, kemik iliğinde ve bazen de beyinde aşırı yağ birikimine neden olan genetik bir hastalıktır^5,6.

Tüm dünyada bu hastalıkların tanısı ve tedavisi zordur¹. Bilgi ve bilinç eksikliği nedeniyle LSD hastalıkla-rından muzdarip çocukların tanı ve tedaviye erişimi gecikmektedir ve bu nedenle %30’u 5 yaşından önce ölmektedir. Lizozomal depo hastalıklarında bazı klinik ve patolojik bulgular hastalıkların tanısında kullanıl-makla birlikte^7, kesin tanı periferik kandan veya dokudan enzim düzey ölçümü veya mutasyon analiz sonuçlarına göre konulabilmektedir⁸. Mutasyon analizi enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların PCR kitleri yardımıyla tespit edilmesini sağlar^1,4,7, bu teknik enzimin üretilip üretilmediği hususuna yanıt verir. Ancak son ürün olan enzim varlığının ölçümü hastalık tanısı için daha önemlidir. Çünkü enzim yeterli düzeyde üretilmemiş veya düzgün katlanmalarla fonk-siyonel halde ortama verilmemiş olabilir. Bu nedenle Gaucher hastalığı için enzim düzey tespiti daha doğru bir yaklaşımdır^9,10. Laboratuvarda enzim düzey ölçümleri ticari Enzimle-İşaretli Immünosorbent Test (ELISA) kitleri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Bu teknik günümüzde kantitatif analiz alanında sıkça kullanılan hassas, seçici, basit ve çok sayıda numuneyi hızlı ve aynı anda analiz edebilen immündiagnostik bir tekniktir^11,12. Tekniğin pratik uygulamalarında enzim-substrat etkileşimi, enzimatik aktivite, inkübas-yon koşulları, yalancı pozitif ve konjugat gibi bir dizi değişken parametre analizin sonucunu etkilemektedir¹³. Tüm faktörler arasında enzimle işaretli antikor (konjugat) tekniğin en kritik reaktifidir^12,14. Gluta-raldehit ve periyodat oksidasyonu gibi geleneksel tekniklerle enzim işaretlenmiş antikorların hassasiyeti nispeten düşük duyarlılığa sahiptir^12,13. Bu durum hedefe yönelik analizlerde sürekli yeni tekniklerin veya reaktiflerin geliştirilmesi ihtiyacını doğurmuştur. Örneğin; biyotin-streptavidin (avidin) konjugat sistemi sinyali güçlendirmek için biyotinlenmiş protein kullanmaktadır^15, immune-PCR yöntemi ise iz miktarda analit tayini için hem ELISA hem de PCR teknolojisinin avantajlarını birleştirerek sinyali güçlendirmektedir^16,17. Bunun yanında enzim bazlı amplifikasyonda analitin hassas tayini için nanopartikül temelli sistemler biyomolekül tayinlerine yeni bir boyut kazandırmıştır¹³. Örneğin; Speroni ve ark.¹⁸ yaptıkları çalışmada antikor kaplı manyetik mikropartikülleri ELISA test sisteminde kullanarak gıdalardaki alerjen maddelerin hassas tespitini gerçekleştirmişlerdir. Tong ve ark. yaptıkları¹³ çalışmada demir oksit nanopartikül işaretli immünosorbent testini (ILISA) geliştirmişlerdir. Demir oksit nanopartikül temelli problar (IONP) goat antikor ile konjuge edilmiş ve fare IgG’ine yüzey ad-sorpsiyonu ile bağlanarak tayin edilmiştir. Enzim-yüklü nanomateryal ile işaretlenmiş antikorlar yüksek enzim kapasitesine sahiptir ve analizlerde dikkate değer sinyal amplifikasyonu oluşturmaktadır^12,19,20. Bununla birlikte antikorla fonksiyonelleştirilmiş nano-partiküllerin hazırlanması sırasında geleneksel immobi-lizasyon yöntemleri kullanılmakta bu da çoğu zaman enzimin stabilitesinde artışa neden olurken aktivitesin-de düşüşe neden olmaktadır^12,13. Geleneksel immobilizasyon çalışmalarında immobilize edilen enzimlerin serbest enzime göre enzimatik aktivitelerinin azalması biyo katalitik sistemlerin uygulamalarını sınırlamaktadır^21-23. Bu nedenle, geliştirilmiş enzimatik etkinliğe sahip enzimlerin hazırlanması için basit, verimli ve ucuz yeni bir yaklaşımın geliştirilmesi gerekmektedir.

Son yıllarda, farklı bir yöntemle organik-inorganik hibrit nano yapılar sentezlenerek protein temelli biyo-malzemelerin kararlılıklarının ve kullanım alanlarının artırılması hedeflenmektedir. İlk defa 2012 yılında farklı bir yöntemle organik-inorganik hibrit nano yapılar sentezlenmiş, enzimlerin aktiviteleri, kararlılıkları ve kullanım alanları artırılmıştır. Rapor edilen yöntemde inorganik bileşen olarak Cu2+ iyonu ve organik bileşen olarak çeşitli protein ve enzimler (laktalbumin, lakkaz, vb) kullanılarak nano yapraklardan oluşan çiçek benzeri şekillere sahip organik-inorganik hibrit nano yapıların oluşumu ve mekanizması açıklanmıştır²⁴. Elde edilen hibrit yapılar mikrometre boyutlarında olmalarına rağmen, nano boyutlu yapraklardan oluşmaları nedeniyle ilk defa bu grup tarafından “nanoflowers” olarak adlandırılmıştır. Geleneksel immobilizasyon teknikleri ile karşılaştırıldığında enzim-inorganik hibrit nano yapıların enzimatik aktivitesi ve kararlılığı serbest enzimlere ve diğer immobilizasyon teknikleri uygulanan enzimlere göre dikkat çekici ölçüde artış göstermektedir²⁵.

Bu çalışmada ilk defa nadir hastalıklar arasında en sık görülen Gaucher hastalığının taramasına yönelik antikorla fonksiyonelleştirilmiş hibrit konjugat sistemleri ELISA test sisteminde kullanılmıştır. Hibrit yapı için optimum sentez koşulu belirlenerek düzgün dağılımlı çiçek morfoloji tespit edilmiştir. Optimum şartlarda elde edilen hibrit konjugatların morfolojisi SEM ile görüntülenmiş, karakterizasyonları ise EDX, XRD ve FTIR analizleri ile yapılmıştır. ELISA test sisteminde ise Sandviç ELISA metodu kullanılmıştır. β-Glucosidase eksikliğinin tespitinde kullanılması muhtemel ticari ürünler ile test sistemi oluşturulmuş optimum çalışma koşulları belirlenmiştir.

Sentezlenen hibrit materyallerin morfolojisi taramalı elektron mikroskobu (FESEM ZEISS GEMINI 500) kullanılarak konfirme edilmiştir. Hibrit malzemenin elementel içeriği EDX (Enerji dağılımlı X-ışınları analizi) analizi, malzemenin kristal yapısı XRD ve kimyasal yapısı ise IR spektrometresi analizi ile aydın-latılmıştır.

Plastik kuyucuklar; hedef molekül içeren (hastalık spesifik antikor), 1:1000 oranında protein/plak PBS, pH 6,8 kaplama solüsyonu ile her kuyuda 100 μl hacim olacak şekilde kaplandı. Plak üzeri seal ile kapatıldı ve +4 ˚C’ de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün plak +4 ˚C’ den çıkarıldı, 1 saat oda sıcaklığında bekletildi. Yıkama tamponuyla (PBS-%0,5 Tween 20) 100 μl/kuyu olacak şekilde 3 defa yıkandı. Plak içi havlu kâğıda hızlıca vurularak kurutuldu. 100 μl/kuyu olacak şekilde 1X blocking reagent-Surmodics ile bloklama yapıldı. Süre bitiminde PBS içinde %5 skim milk ha-zırlandı ve 200 μl/kuyu olacak şekilde kuyulara ilave edildi, 1 h inkübasyon sonrası farklı aralıklarda standart (β-Glucosidase (Sigma)) ilave edildi. 30 dk ila 1 saat 37 ˚C’ de veya oda sıcaklığında karanlıkta inkü-be edildi. Süre bitiminde plak içi aspire edildi. Ardın-dan hibrit konjugatın farklı konsantrasyon aralığında fosfat tampon içerisinde stok çözeltileri hazırlandı ve 100 μl/kuyu olacak şekilde kuyucuklara dağıtıldı. Çal-kalayıcı üzerinde inkübasyon süresi bitiminde yıkama tamponu ile 100 μl/kuyu olacak şekilde 3 defa yıkandı. Plak içi havlu kâğıda hızlıca vurularak kurutuldu. TMB Substrat 100 μl/kuyu olacak şekilde ilave edildi, 10-15 dk karanlık ortamda oda sıcaklığında bekletildikten sonra 1 M H₂SO₄ çözeltisinden 50 μl/kuyu olacak şekilde ilave edildi ve 450 nm’de okuma yapıldı. ELI-SA yöntemlerinde “cut off” değerinden yüksek olan durumlar pozitif yanıt olarak değerlendirilmiştir. Cut off değeri aşağıdaki eşitlikte olduğu gibi belirlenmiştir. Cut off = Ortalama negatif kontrol + (Standart sapma negatif kontrol)2.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: ELISA test sisteminde kullanılan antikor tür/marka ve stok konsantrasyonları.

Bu antikorlar aynı zamanda ELISA test sisteminin oluşturulmasında da kullanılmıştır. Geleneksel yöntem ve hibrit konjugatın karşılaştırması yapılmadan önce malzemenin morfolojisi incelendi. Hibrit konjugatın sentez şartları bileşenlerin konsantrasyonu (sekonder antikor, enzim, metal iyonu vb.) oluşan yapıların mor-folojisini çok etkilemektedir. Antikor-HRP-inorganik hibrit yapı sentezinde Ab 1, Ab 2 ve Ab 3 ayrı ayrı ve her birinden iki farklı konsantrasyon (10 ve 20 μl stok solüsyon) olacak şekilde hibrit yapı sentezlenmiş olup morfolojileri SEM ile görüntülenmiştir. Şekil 1’de hibrit yapıların SEM görüntüleri verilmiştir.

Şekil 1: Antikor-HRP-inorganik hibrit konjugat yapıların SEM görüntüsü.

Şekil 1’de yer alan SEM görüntülerinde yapraklar merkezden köken almış ve yaklaşık 3,6-6,0 μm boyu-tunda çiçek morfoloji elde edilmiştir.

Hibrit konjugatın Cu, P, C, O ve N gibi elementlerin ağırlık ve atom yüzdelerini belirlemek için EDX analizi yapıldı. Spektrum şekil 2’de gösterilmiştir.

Şekil 2: Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugatın EDX spektrumu.

Toz difraksiyon spektrumunda ise Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugatın pik pozisyonları ve yoğun-lukları verilmiştir. Şekil 3’de görüldüğü üzere piklerin kırınımları JCPDS kart numarası 00-022-0548 olan Cu₃(PO₄)2.3H₂O kristal modeli ile iyi uyum sağlamıştır.

Şekil 3: Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugatın XRD spektru-mu (JCPDS card no: 00-022-0548, Cu₃(PO₄)₂.3H₂O).

Serbest HRP, serbest Ab 1 ve Antikor-HRP-inorganik hibrit konjugatın kimyasal yapıları FTIR spektrumları ile karşılaştırıldı (Şekil 4).

Şekil 4: (a) Serbest HRP (b) Serbest Ab 1 ve (c) Antikor-HRP-inorganik hibrit konjugatın FTIR spektrumları.

FTIR spektrumunda Antikor-HRP-inorganik hibrit konjugat serbest HRP ve serbest Ab 1 bulunan tüm pikleri içermiştir. Bu sonuçlar karboksil/amino grupları ile bakır iyonu arasındaki koordinasyonu göstermiş ve hibrit yapının iyi kristalleştiğini kanıtlamıştır.

ELISA test sisteminin oluşturulması amacıyla tablo 1’de yer alan antikorlar kullanılarak çok sayıda para-metre ELISA’da test edilmiş olup optimum sonuç alı-nan deneysel koşullar ile ilgili etkili sonuçlar paylaşılmıştır. Yapılan denemelerde plak Anti-GBA 3 antikoru (1:1000) ile kaplandıktan sonra bloklama ajanı (1X stabilcoat) ile 1 h inkübe edilmiştir. Bloklama sonrası 10-25 ng/mL aralığında -Glucosidase (standart) ilave edilip, 1h sonunda HRP işaretli Anti-GBA 1 antikoru (1:100) eklenmiştir, 15 dk inkübasyon sonrası şekil 5’de gösterilen tipik standart eğri elde edilmiştir.

Şekil 5: 10 ile 25 ng/mL arasındaki antijen konsantrasyonu aralığını kapsayan ELISA için standart eğri.

Elde edilen sonuçlara göre bloklama işleminde değişik-liğe gidilmiştir. Plak kaplaması aynı kalacak şekilde (Anti-GBA 3 antikoru, 1:1000), bloklamada 1X stabil-coat ajanı sonrası PBS içinde %5 skim milk ile 1 h inkübasyon gerçekleştirilmiş. 20-30 ng/mL aralığında standart aralığı oluşturulmuştur, 30 dk sonucunda HRP işaretli Anti-GBA 1 antikoru (1:200) eklenmiş, 30 dk inkübasyon sonrası şekil 6’da gösterilen tipik standart eğri elde edilmiştir.

Şekil 6: 20 ile 30 ng/mL arasındaki antijen konsantrasyonu aralığını kapsayan ELISA için standart eğri.

Artan R² değeri protein/plak konsantrasyonu ve blok-lama sistemine karar vermemizi sağlamıştır. Aynı koşullarda Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugat sistemi çalışılmış olup 12,5-400 ng/mL aralığında stan-dartlar ilave edilmiştir. 1 h inkübasyon sonrası konjugat olarak 2 μg/mL konsantrasyonda Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugat ilave edilmiş ve 30 dk çalkalayıcı üzerinde inkübe edilmiştir. Standart işlemler sonrası şekil 7’de gösterilen tipik standart eğri elde edilmiştir.

Şekil 7: 12,5-400 ng/mL arasındaki antijen konsantrasyonu aralığını kapsayan ELISA için standart eğri.

Hibrit sistemde konjugat (Ab 1(10 μl)-HRP-inorganik hibrit yapı) klasik ELISA sistemine göre daha yüksek yanıt vermiştir. Klasik yöntem için Lineer analitik performans R² >0.99 ve LOQ değeri 10 ng/mL olarak belirlenmiştir. Hibrit konjugat sisteminde ise R² >0.99 ve LOQ değeri 12,5 ng/mL olarak belirlenmiştir.

Bu çalışmada ilk defa nadir hastalıklar arasında en sık görülen Gaucher hastalığının taramasına yönelik antikorla fonksiyonelleştirilmiş hibrit konjugat sistemleri ELISA test sisteminde kullanılmıştır. Hibrit yapı için optimum sentez koşulu belirlenerek düzgün dağılımlı çiçek morfoloji tespit edilmiştir. SEM görün-tülerinde yapraklar merkezden köken almış ve yaklaşık 3,6-6,0 μm boyutlarında çiçek morfoloji elde edilmiştir. Sentezde kullanılan antikor ve enzim miktarındaki farklılık hibrit yapının boyutunda önemli bir değişikliğe sebep olmamıştır. Antikor ve enzim içeren hibrit yapıların nano boyutlu çok sayıda yapraklardan oluş-ması ile yüzey alanı artmaktadır. Sentezlenen bu yapı-ların karakterizasyonları gerçekleştirilmiş veeş zamanlı olarak hibrit yapıların ELISA test sistemindeki kullanı-labilirlikleri de araştırılmıştır. Yapılan çok sayıda test sonucunda ELISAsisteminde en yüksek ve anlamlı sonucu veren Ab 1 (10μl)-HRP-inorganik hibrit konju-gatın karakterizasyon analiz sonuçlarına çalışmada yer verilmiştir. Sentezlenen hibrit konjugat antikor ve me-tal fosfat nanokristalleri olmak üzere iki ana bileşen içermektedir. Hibrit konjugatın EDX spektrumunda N ve Cu, P, C, O pikleri sırasıyla antikor ve Cu3(PO4)2·3H2O nanokristallerinden kaynaklanmakta-dır. EDX spektrumunda yer alan Cl elementinin varlığı ise fosfat tamponundan kaynaklanmıştır. Ab 1 (10μl)-HRP-inorganik hibrit konjugatın pik pozisyonları ve yoğunlukları JCPDS kart numarası 00-022-0548 olan Cu3(PO4)2.3H2O kristal modeli ile iyi uyum sağladığını göstermiştir. FTIR spektrumunda serbest formda ~570 cm-1 ve ~620 cm-1 ’de gözlenen O=P-O grubu frekansı hibrit edilmiş yapıda ~550-650 cm-1 ’deki frekanslarına kayma göstermiştir. Serbest antikorda yer alan peptit bağının C=O titreşimi, N-H bükülmesi ve C-N titreşimi ile amit I bandı ~1656 cm-1 ve amid II bandı ise ~1546 cm-1 da pik vermiştir. ~990 cm-1, ~1075 cm-1 ve ~1146 cm-1 ’deki bantlar P=O grubuna spesifiktir. –NH2 gru-bunun titreşim bandı serbest HRP enziminde ~1634 cm−1 iken hibrit yapıda kayma göstererek ~1400-1680 cm−1 titreşim aralığında görünmektedir. ~3000 cm-1-3400 cm-1 aralığında yer alan bantlar -CH2 ve -CH3 gruplarına aittir, serbest HRP ve antikor molekülünde bu bantlar şiddetli iken hibrit yapıda daha zayıf olarak görülmüştür. Veriler oluşturulan ELISA sisteminin analitik duyarlılığının yüksek olduğunu göstermiştir. Hibrit konjugat sistemi ile daha ucuz ve kolay ulaşıla-bilen bir sekonder antikor olan Anti-human IgG (Fab) HRP’nin kullanıldığı gelenekseltest sistemine yakın hassasiyette sonuç vermiştir.

Zhang ve ark.²⁸ benzer yöntemle yaptıkları çalışma-da ractopamine antikoru (RACanti) kullanarak Mn3(PO4)2–protein hibrit nanokompozitleri sentezle-mişlerdir. Mn3(PO4)2@RACanti nanokompozitler, rak-topenin (RAC) tespiti için kullanılan elektrokimyasal bir biyosensörün hassas tabakası olarak kullanılmıştır. Sentezlenen Mn3(PO4)2 benzeri nano çiçeklerin yüksek kimyasal aktivite ve mükemmel elektrokimyasal performans sergilediği gösterilmiştir. Liu ve ark.²⁹ ise yaptıkları çalışmada Streptavidin (SA)-HRP enzimini içeren hibrit yapıyı iki farklı fonksiyonda kullanabil-mek amacı ile organik-inorganik hibrit yapı sentez yöntemini kullanarak sentezlemişlerdir. Sentezlenen SA-HRP-Cu3(PO4)2 hibrit nano çiçekler biyoanalizde serbest form ile karşılaştırıldığında yüksek katalitik aktivite, stabilite ve dayanıklılık göstermiştir. Çift fonksiyonlu hibrit nano çiçekler enzim bağlı immün-sorbent analizde alfa-fetoprotein (AFP) için 78 pg/mL tespit limitine sahip ultra duyarlı bir sensör oluşturmak için kullanılmıştır. Ye ve ark.³⁰ ise yaptıkları çalış-mada inorganik mineral posnjakit (Cu4(SO4) (OH)6·H2O) yapısını streptavidin ve HRP için nano taşıyıcı görevi görmesini sağlayarak insektisidal krista-lin (Cry) protein Cry1Ab'nin tespiti için lineer aralık 0.1-40 ng mL-1 ve tespit limiti ise 63 pg mL-1 olan immün analizde sinyal etiketi olarak kullanmışlardır.

Zeinhom ve ark.³¹ yaptıkları çalışmada tespit anti-koru-HRP enzim ve inorganik nano çiçek içeren nano-kompozit ile streptavidin manyetik boncuklar ve biyo-tin etiketli antikoru yakalama platformu olarak kullanarak S. Enteritidis ile inoküle edilmiş süt, peynir ve su örneklerinde S. Enteritidis tespit edebilen görsel renk üreten bir test sistemi geliştirmişlerdir. Geliştirilen test suda 1.0 CFU mL−1, süt ve peynirde ise 1.0 CFU/g algılama limiti ile S. Enteritidis’i tespit edebilmiştir.

Wei ve ark.¹² ilk kez hibrit protein-inorganik nano ciçeğe enzim, antikor ve Cu3(PO4)2'yi üçlü bir şekilde immobilizasyonunu sağlamışlardır. Çalışmada çift fonksiyon kazanan yapının antikor kısmı, karşılık gelen antijeni özgül bir şekilde yakalama yeteneğini koru-muştur. Bunun yanında nano çiçek, artan enzimatik aktivite ve stabiliteye sahip olarak sinyali güçlendirmiştir. Elde edilen antikor-enzim-inorganik nano çiçek, önce Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) tespiti için enzim-işaretli antikor olarak enzim bağlı immünosorban testinde uygulandı. Tespit limiti 60 CFU L (-1) olarak belirlenmiştir.

Yin ve ark.³² ise yaptıkları çalışmada Staphylococ-cus aureus’un tespiti için bir biyolojik hibrit nano yön-tem geliştirmişlerdir. Metodun merkezinde bir spesifik hücre duvar bağlama domain (CBD) ile HRP enzimi ve Cu3(PO4)2 inorganik hibrit nano çiçek sentezlemede kullanılmıştır. Plak anti-S. Aureus poliklonal antikoru ile kaplanmıştır üzerine CBD-HRP-Cu3(PO4)2 organik-inorganik hibrit nano çiçek ilave edilmiştir. HRP enzi-minin aktivasyonu için TMB eklenmiştir. Yöntemin, 101 ila 106 koloni oluşturan birim (CFU)/mL aralığında lineer olarak 6 CFU/mL' ye kadar olan tespit sınırlarıy-la S. aureus' u özgül olarak tespit etme kapasitesi kanıt-lanmıştır.

Bu çalışmada ise ilk defa Gaucher hastalığının tanısın-da fonksiyonel konjugat sistemi kullanılmıştır. Gele-neksel sandviç ELISA sisteminde Anti-GBA 1 konju-gatı yüksek yanıt verirken fonksiyonel konjugat siste-minde Ab 1 (10 μl)-HRP-inorganik hibrit konjugatı daha yüksek yanıt vermiştir. Klasik yöntem için Lineer analitik performans R2 >0.99 ve LOQ değeri 10 ng/mL olarak belirlenirken hibrit konjugat sisteminde ise R2 >0.99 ve LOQ değeri 12,5 ng/mL olarak belirlenmiştir. Bulgular, fonksiyonelleştirilmiş hibrit konjugat sisteminin yüksek antijen bağlama kapasitesiyle çalıştığını ve tespit limitinin ticari ELISA sistemlerine yakın olduğunu ortaya koymuştur. Çalışma sonuçları tekrarlanabilirlik ve stabilite ile ilgili ileri çalışmalara ihtiyaç duymakla birlikte organik-inorganik hibrit nano çiçek teknolojisi inovatif biyomühendislik yaklaşımları ile diagnostik alanda geleneksel ELISA sistemine yeni bir alan yaratarak işaretlenmesi zor antikorların tek basa-makta HRP enzimi ile birleştirilerek test sistemlerine dahil edilebileceği potansiyelini göstermiştir. Bu yakla-şım, biyosensör, biyotıp ve biyokatalitik süreçlere kadar çeşitli uygulamalar için umut vaat edici olarak belirlenmiştir.

“Bu çalışma Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından BBAP20F14 proje kodu ile desteklenmiştir.”

1) Schultz ML, Tecedor L, Chang M, Davidson BL. Clarifying lysosomal storage disease. TINS 2011; 34, 8: 401-10.

2) Pastores GM, Hughes DA Non-neuronopathic lysosomal storage disorders: Disease spectrum and treatments. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015; 29: 173-82.

3) Wilcox WR Lysosomal storage disorders: the need for better pediatric recognition and comprehensive care. J Pediatr 2004; 144: 3-14.

4) Lampe C, Bellettato CM, Karabul N, Scarpa M. Mucopolysaccharidoses and Other Lysosomal Storage Diseases. Rheum Dis Clin N Am 2013; 39: 431-55.

5) Bellettato CM, Hubert L, Scarpa M, Wangler M.F. Inborn errors of metabolism involving complex molecules. Pediatr Clin N Am 2018; 65: 353-73.

6) Kuku İ, Kaya E, Yıldız R, Harputluoğlu H, Aydoğdu İ, Gürakan F. Gaucher Hastalığı: iki olgu sunumu. İç Hast Der 2002; 9-4: 158-61.

7) Gelmez Beker D, Aliyazıcıoğlu Y, Lizozomal Depo Hastalıklarının Tanı ve Tedavisinde Yeni Yaklaşımlar. OMÜ Tıp Dergisi 2002; 19: 78-82.

8) Sosyal Güvenlik Kurumu Sağlık Uygulama Tebliği, Madde 4.2.10 Lizozomal hastalıklar için tedavi ilkeleri.

9) Kingma SDK, Bodamer OA, Wijburg F.A. Epidemiology and diagnosis of lysosomal storage disorders; challenges of screening. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015; 29: 145-57.

10) Solomon M, Muro S. Lysosomal Enzyme Replacement Therapies: Historical Development, Clinical Outcomes, and Future Perspectives. Adv Drug Deliv Rev 2017; 118: 109-34.

11) Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA). Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 8: 871-4.

12) Wei T, Du D, Zhu MJ, Lin Y, Dai Z. An Improved Ultrasensitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Hydrangea-Like Antibody-Enzyme-Inorganic Three-in-One Nanocomposites. ACS Appl Mater Interfaces 2016; 8: 6329-35.

13) Tong S, Ren B, Zheng Z, Shen H, Bao G. Tiny Grains Give Huge Gains: Nanocrystal-Based Signal Amplification for Biomolecule Detection. ACS Nano 2013; 25: 5142-50.

14) Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics, Br J Hosp Med 2016; 77: 98-101.

15) Chu YW, Wang BY, Lin HS et al. Layer by Layer Assembly of Biotinylated Protein Networks for Signal Amplification. Chem Commun 2013; 49: 2397-9.

16) Zhang W, Bielaszewska M, Pulz M et al. New Immuno-PCR Assay for Detection of Low Concentrations of Shiga Toxin 2 and Its Variants. J Clin Microbiol 2008; 46: 1292-7.

17) Bu D, Zhuang H, Yang G, Ping X. A real-time immuno-PCR assay for the detection of tetrabromobisphenol A. Anal Methods 2015; 7: 99-106.

18) Speroni F, Elviri L, Careri M, Mangia A. Magnetic particles functionalized with PAMAM-dendrimers and antibodies: a new system for an ELISA method able to detect Ara h3/4 peanut allergen in foods. Anal Bioanal Chem 2010; 397: 3035-3042.

19) Lin H, Liu Y, Huo J et al. Modified Enzyme-linked Immunosorbent Assay Strategy Using Graphene Oxide Sheets and Gold Nanoparticles Functionalized with Different Antibody Types. Anal Chem 2013; 85: 6228-32.

20) Qu ZY, Xu H, Xu P et al. Ultrasensitive ELISA Using Enzyme-Loaded Nanospherical Brushes as Labels. Anal Chem 2014; 86: 9367-71.

21) Wang LB, Wang YC, He R et al. A new nanobiocatalytic system based on allosteric effect with dramatically enhanced enzymatic performance. J Am Chem Soc 2013; 135: 1272-5.

22) Netto CGC, Toma HE, Andrade LH. Superparamagnetic nanoparticles as versatile carriers and supporting materials for enzymes, J Mol Catal B Enzym 2013; 85: 71-92.

23) Altinkaynak C, Yilmaz I, Koksal Z, Özdemir H, Ocsoy I, Özdemir N. Preparation of lactoperoxidase incorporated hybrid nanoflower and its excellent activity and stability. Int J Biol Macromol 2016; 84: 402-9.

24) Ge J, Lei J, Zare RN. Protein-inorganic hybrid nanoflowers, Nat Nanotechnol 2012; 7: 428-32.

25) Altinkaynak C, Tavlasoglu S, Ozdemir N, Ocsoy I. A new generation approach in enzyme immobilization: organic-inorganic hybrid nanoflowers with enhanced catalytic activity and stability. Enzyme Microb Technol 2016: 93; 105-12.

26) Lee SW, Cheon SA, Kim MI et al. Organic-inorganic hybrid nanoflowers: types, characteristics, and future prospects. J Nanobiotechnol 2015: 13: 54.

27) Subramani IS, Perumal VP, Gopinath SCB, Fhan & Norani KS, Mohamed M. Organic-Inorganic Hybrid Nanoflower Production and Analytical Utilization: Fundamental to Cutting-Edge Technologies. Crit Rev Anal Chem 2022; 52: 1488-510.

28) Zhang Z, Zhang Y, Song R et al. Manganese (II) phosphate nanoflowers as electrochemical biosensors for the high-sensitivity detection of ractopamine. Sens Actuators B Chem 2015; 211: 310-7.

29) Liu Y, Chen J, Du M, Wang X, Ji X, He Z. The preparation of dual-functional hybrid nanoflower and its application in the ultrasensitive detection of disease-related biomarker. Biosens Bioelectron 2017; 92: 68-73.

30) Ye R, Xu H, Gu J, Chen H. Bioinspired synthesis of protein-posnjakite organic-inorganic nanobiohybrid for biosensing applications. Anal Chim Acta 2021; 25: 31-6.

31) Zeinhom MMA, Wang Y, Sheng L et al. Smart phone based immunosensor coupled with nanoflower signal amplification for rapid detection of Salmonella Enteritidis in milk, cheese and water. Sens Actuators B Chem 2018; 261: 75-82.

32) Yin W, Zhu L, Tang Q, Ma Y, Chou SH, He J. Bio-hybrid nanoarchitectonics of nanoflower-based ELISA method for the detection of Staphylococcus aureus. Sens Actuators B Chem 2022; 366: 132005.