Deney hayvanları
Deneylerde Fırat Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Merkezinde üretilen 30 adet Wistar cinsi, 200-300g. ağırlığında erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlara standart şartlarda (12 saat ışık, 12 saat karanlık, havalandırmalı, sabit ısılı odalarda), özel kafeslerde bakıldı. Sıçanların başlangıç ve sonuç ağırlıkları ile içtikleri su miktarları hergün ölçüldü. Sıçanlar 8 mm’lik standart sıçan pellet yemi ile beslendi. Tüm deney prosedürlerinde “ Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu” prensiplerine titizlikle uyuldu.
Deneysel Protokol
Sıçanlar 3 gruba ayrıldı.
Kontrol grubu (KONTROL): Deney süresi boyunca bu grup sıçanlara hiçbir uygulama yapılmadı (n=10).
Sabit doz L-NNA grubu (S-LNNA): Sıçanlara içme suyunda 69±mol/L konsantrasyonda L-NNA 3 hafta süreyle verildi. Aldıkları ortalama doz yaklaşık 22±0,2 mg/kg/gün olarak hesaplandı (n=10).
Kademeli doz L-NNA grubu (K-LNNA): Sıçanlara içme suyunda ilk hafta 23 ±mol/L, 2.hafta 69±mol/L, 3.hafta 207 Umol/L konsantrasyonda L-NNA verildi. Verilen ortalama yaklaşık doz ilk hafta 7 mg/kg/gün, 2.hafta 20, 4±0,1 mg/kg/gün, 3.hafta 60,9±0,5 mg/kg/gün L-NNA şeklinde hesaplandı (n=10).
Deney süresince S-LNNA ve K-LNNA gruplarına verilen total L-NNA miktarı arasında anlamlı bir farklılık gözlenmedi.
Bilinci açık sıçanların sistolik kan basıncı ve kalp hızı ölçümleri kuyruktan indirekt tail-cuff yöntemi ile yapıldı (MAY BPHR 9610-PC Tail-Cuff Indirect Blood Pressure Recorder. Commat Ltd., Ankara, Türkiye). Sıçanların kan basıncı ve kalp hızı ölçümleri L-NNA uygulamaya başlamadan önce (0.gün) ve L-NNA uygulamaya başladıktan sonra 7, 14, 21. günlerde 3 hafta süreyle ölçüldü. Her bir denek tek başına olarak muhafaza edici bir kutuya kondu ve sonra deneğin kuyruğuna tail-cuff cihazının cuff ve sensörü yerleştirildi.
Sıçanların kuyrukları düzenli sinyal sesi ve pulse (atım) alana kadar 37-38 Co de 10- 20 dakika süreyle MAY TWC 02 Tail Warming Controller (Commat Ltd., Ankara, Türkiye) ile ısıtıldı. Ölçümler sessiz ve sakin laboratuvar ortamında deneğin rahat ve sakin olduğu, düzenli sinyal sesinin alındığı anda yapıldı ve değerler bilgisayara kaydedildi. Herbir, sıçandan en az 5 ölçüm alınıp bu değerlerden en yüksek ve en düşük olanı çıkarılarak geri kalan 3 değerin ortalamaları hesaplandı.
Cerrahi İşlemler
Üçüncü haftanın sonunda sıçanlar hassas terazi ile tartıldıktan sonra servikal dislokasyon yöntemi ile öldürüldü. Sıçanlar orta hattan kesilerek açılıp sol ventrikülden enjektör ile kan alındıktan sonra her bir sıçanın sol böbreği etraf bağ ve yağ dokulardan temizlenip standart bir şekilde total olarak çıkarıldı.
Plazma NOx ölçümü
Sıçanlardan alınan kan örneklerinin plazma NOx konsantrasyonları daha önce laboratuvarımızda çalışılan Cortas ve Wakid’in bildirdiği yöntemle tespit edildi 13,14. Kısaca özetlenirse, alınan kanlar ETDA’lı tüplere konularak 5000g’de santrüfüj edildi. Plazmalar ayrılarak ölçüm yapılana kadar –20 santigrat derecede saklandı. Ölçüm sırasında plazmalardan 250µl alınarak üzerine 1ml çinko sülfat çözeltisi eklenip vortekslendikten sonra 1,250 µl sodyum hidroksit çözeltisi ilave edildi. 3500g de 10 dakika boyunca santrifüj edildikten sonra üstteki çözelti kısmı alınarak üzerine 2 ml distile su 1 ml glisin tamponu eklenerek yıkanmış kadmiyum granüllerinin üzerine eklendi. Doksan dakika boyunca karanlıkta inkübe edildikten sonra 2 ml indirgenmiş numune alınarak üzerine 1 ml sülfanilamid 1ml naftiletilendiamin çözeltisi 0.5 ml distile su ilave edildi. Yirmi-60 dakika bekletildikten sonra 545 nm dalgaboyunda ölçüm yapıldı.
Böbrek/Vücut Ağırlığı (B/V) İndeksi
Sıçanların sol böbrekleri kurutma kağıdı ile kurutulduktan hemen sonra hassas terazi ile tartıldı. Herbir sıçan için ayrı ayrı tüm böbrek ağırlığı tüm vücut ağırlığına bölünerek böbrek/vücut ağırlığı indeksi tespit edildi.
İstastistik
Elde edilen veriler ortalama ± standart hata olarak belirlendi. Elde edilen verilerin istatistiksel anlamlılık düzeyleri ‘ Origin 5.0 ’ istatistik programı kullanılarak studentt ve ANOVA testi ile belirlendi. p<0,05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.