Bu çalışma Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Dermatoloji polikliniğine başvuran, 18 yaşından büyük, normal vücut kitle indeksine (VKİ) sahip, gebe olmayan, diabet, hipertiroidi ve hipotiroidisi bulunmayan, herhangi bir kanser öyküsü olmayan, alkol kullanmayan, herhangi bir sistemik ilaç tedavisi almayan ve gönüllü 30 vitiligo hastası ve aynı şartlara sahip 20 sağlıklı gönüllü kontrol grubu toplam 50 kişilik katılımcıdan oluşmaktadır. Çalışmaya katılan hastalar diğer otoimmün hastalıklar açısından dışlanmıştır. Kayıtlı her bir hasta ve sağlıklı kontrol bireyleri için Bilgilendirilmiş Hasta Onay formu doldurulmuştur. Çalışma Fırat Üniversitesi Girişimsel Olmayan Araştırmalar Etik Kuruluna sunulmuş ve 08/01/2015 tarih ve 71055 sayılı karar numarası ile onay alınmıştır.
Çalışmaya alınan her bir katılımcıdan sabah aç karnına biyokimya tüplerine 5 ml venöz kan örneği alınmış ve bu şekilde toplanan kan örnekleri derhal santrifüj edilerek elde edilen serumlar -20°C derecede buzdolabında çalışma gününe kadar saklanmıştır. Çalışma gününde serum örnekleri çözdürülerek MDA, ADMA, homosistein, vitamin A ve E düzeyleri çalışılmıştır. Aynı zamanda bu hastaların lipit düzeyleri, bel çevresi, boy ve VKİ ölçülmüş ve kaydedilmiştir.
Serum Vitamin A, Vitamin E, MDA, Homosistein ve ADMA Düzeyi Ölçümü
Serum vitamin A, vitamin E, MDA, Homosistein ve ADMA düzeyleri Shimatsu marka High Performance Liquid Chromatography-Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) cihazı ile immuchrom GmbH (Hessen, Germany) kiti kullanarak kit prosedürüne uygun olarak çalışılmıştır.
Vitamin A/E Tayini
Analiz öncesinde numuneler oda sıcaklığına alındı. 250 µl serum üzerine 50 µl internal standard ve 500 µl çökeltme reaktifi ilave edilerek 30 dakika 2-8oC'de inkübasyona bırakıldı. Daha sonra 10.000g'de 2 dk santrifüj edildi. Süpernatantdan 100µl HPLC sisteminde akış hızı: 0.8 ml/dk, dalga boyu vitamin A için 325, vitamin E için 300 nm'de C18 kolonu kullanılarak vitamin A ve E tayin edildi.
MDA Tayini
Serum örneğinden 20 µl alınarak üzerine 1 ml türevlendirme solüsyonu ilave edilerek proteinler çöktürüldü. Sonra 60 dk 95°C'de su banyosunda inkübasyona bırakıldı. 2-8°C'de örnekler soğutulduktan sonra 10.000g'de 5 dk santrifüj edildi. Süpernatantdan 500 µl alınıp aynı hacimde reaksiyon solüsyonu ile karıştırıldıktan sonra HPLC sisteminde akış hızı: 0.8-1.0 ml/dk, eksitasyon 515, emisyon 553 nm dalga boyunda MDA tayin edildi.
Homosistein Tayini
Serum örneğinden 50 µl alınarak üzerine 50 µl internal standart, 20 µl redüksiyon solüsyonu, 100 µl türevlendirme solüsyonu ilave edilerek 10 dk 60°C'de inkübe edildi. Örnekler 2-8°C'de soğutulduktan ve 100 µl çöktürücü ajan eklendikten sonra 10.000g'de 5 dk santrifüj edildi. Süpernatandan 20 µl alınarak HPLC sisteminde akış hızı: 0.7-1.0 ml/dk, eksitasyon 385, emisyon 515 nm dalga boyunda homosistein düzeyi tayin edildi.
ADMA Tayini
Asimetrik dimetilarginin tayini için özetle, 20 mg 5-sülfosalisilik asit 1 ml seruma eklendi ve karışım buz banyosunda 10 dakika bekletildi. Çökmüş olan protein 2000g'de 10 dk santrifüj ile uzaklaştırıldı. Süpernatantın 10 µl'si filtre edildikten sonra 100 µl türevlendirme reaktifi ile karıştırıldı ve kromatografik sisteme enjekte edildi. Asimetrik dimetilargininin ayırımı için 250 mm X 4.6 mm ölçülerinde Fenil kolon kullanıldı. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sisteminde akış hızı 1 ml/dk, eksitasyon 420, emisyon 483 nm dalga boyunda ADMA tayin edildi. Linearite > 16.0 µmol/L, sensitivite <0.01 µmol/L'dir.
İstatistik
Tüm veriler SPSS 22.0 istatistik paket programı kullanılarak değerlendirildi. Değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu Kolmogorov-Smirnov testi ile incelendi. Gruplar arası karşılaştırmada, normal dağılım gösteren parametreler için bağımsız örneklerde Student-t testi, normal dağılım göstermeyen değişkenler için Mann-Whitney U testi kullanıldı. p<0.05 olan değerler anlamlı olarak değerlendirildi.