[ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]
Fırat Tıp Dergisi
2004, Cilt 9, Sayı 3, Sayfa(lar) 075-078
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
AgNOR Yöntemi ile Insan Epidermisinden Yaş Tespiti
Aysun BARANSEL ISIR 1, Kemal BAKIR 2, Ramazan UÇAK 2, Hikmet Ergin DÜLGER 1
1 Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Adli Tıp Anabilim Dalı,GAZİANTEP
2 Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, GAZİANTEP
Anahtar Kelimeler: AgNOR, yaş tespiti, adli tıp, küçük doku,AgNOR (Silver stained nucleolar organizer region), age estimation, forensic medicine, small tissue.
Özet
Amaç:
Özellikle kimlik tespiti yapılamamış postmortem örneklerden, yaş tespiti yapılması adli tıp için henüz netlik ve pratik uygulamada kolaylık gösterememiş, oldukça önemli bir problem olmaya devam etmektedir. Bu amaçla normal hücrelerin proliferatif aktivitesine göre degerlendirilen kantitatif metodlar denenmektedir. Biz de çalışmamızda AgNOR boyama yöntemi ile insan epidermisinden alınan küçük doku örnekleri ile özellikle kimligi belirlenememiş postmortem olgularda yaş tespitinin yapılabilirligini göstermeyi amaçladık.

Gereç ve Yöntem:
Bu çalışmada mitotik aktivite, nükleolar organize edici bölgelerin gümüşle boyanması esasına dayalı AgNOR yöntemiyle incelendi ve ortalama proliferatif indeks elde edildi. Bu indekse baglı AgNOR dagılımları skoru yaş gruplarına göre ilişkilendirildi.

Bulgular:
Çalışmaya geçmişinde herhangi bir tümoral hastalık hikayesi olmadıgı ögrenilen postmortem örneklerin toplandıgı, yeni dogan (0-12 ay), infant (1-5 yaş), erişkin (25-35 yaş), 50 yaş ve üzeri olmak üzere 23 Erkek (E), 15 Kadın (K) toplam 38 olgudan 4 yaş grubu oluşturuldu. Yaş gruplarına göre AgNOR dagılım skorları arasında fark saptandı ve istatistiksel olarak anlamlı korelasyon bulundu (p<0.01).

Sonuç:
Bu çalışma ile postmortem küçük dokulardan AgNOR boyama yöntemi ile yaş tespiti yapılabilecegi, ancak saglıklı bir degerlendirme için daha geniş vaka serilerine ihtiyaç oldugu sonucuna varıldı. ©2004, Fırat Üniversitesi, Tıp Fakültesi

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Giriş
    Adli tıpta yaş tayini oldukça önemli bir konudur. Yaş; cinsiyet, boy, vücut agırlıgı, saç, cilt, göz rengi, parmak izi, kemik ve dişler gibi bireyin tıbbi kimligini oluşturan fiziksel yapılardan biridir.

    Özellikle Adli tıpta cezai sorumluluk, hukuki ehliyet, farik ve mümeyyizlik, ahlaki readet fiili, ruhsal yönden mukavemet, askere alınma, memuriyete girme, okula başlama, emekli olma, sürücü belgesi alma gibi durumlarda kişinin yaş tespiti yasalara uygunluk açısından gündeme gelmektedir 1. Bu konuda birçok yöntem bulunmakla birlikte küçük dokulardan yaş tayini yapabilmek, adli tabiplere büyük kolaylıklar getirebilecektir.

    Tanı amacıyla neoplastik dokuların, nonneoplastik dokulardan veya benign lezyonların malign lezyonlardan ayrılmasında etkili bir yöntem olan AgNOR’un degişik yaş gruplarında lenfositlerde farklı sayıda NOR beneklerini boyaması nedeniyle 2-6 farklı dokularda da yaş tayinine yardımcı olabilecegi düşünüldü.

    Histopatologlar, hastalıkların etiyopatogenezinde rol alan unsurların etkisi sonucu, nükleus, DNA ve hücre kinetigine yönelik, DNA flow sitometri (DNA ploidi ve hücre proliferasyonu) hücre proliferasyon belirleyicisi olan Ki-67 monoklonal antikor çalışmaları ve DNA-RNA in situ hibridizasyon yöntemlerine, Nükleolar Organizasyon Bölgeleri (NOR) üzerindeki degişimlerin araştırılmasını eklediler. Bu çalışmalarda hiperplastik ve neoplastik durumlarda nükleolus ve nükleolar aktivasyonun belirlenmesinin yararlı oldugu düşünülmüştür ]2.

    Mc Clintock 1934’de karyotipte 2.darlık olarak gözledigi kısma “Nücleolar organizer regions” (NORs) adını vermiştir. NOR terimi nükleolün köken aldıgı bölgeyi tanımlamaktadır. Nükleolar Organizasyon Bölgeleri (NOR), ribozamal RNA’nın kodlandıgı kromozamal segmentlerdir. RNA polimeraz 1, B23 protein ve C23 proteinler gibi non-histon proteinlerle assosiye haldedirler. AgNOR boyama yönteminde özellikle non-histon komponentinin tepkimeye girdigi ortaya konmuştur 2-8. NORs proteinleri, ribozamal DNA veya olası transkripsiyon düzeyinin göstergesi olarak görülmekte olup, AgNOR bölgelerinin gösterilmesinin hücre proliferasyon hızı, ploidi, transkripsiyonel aktivite ve tümörün malignite potansiyelinin degerlendirilmesi açısından yararlı olduguna dair (deri, meme, lenfoid doku, kadın genital sistem, mesane, GIS) yayınlar vardır 9.

    Günümüzde çok yönlü sürdürülen çalışmalar, yaş tespiti için en uygun yöntemin araştırılması üzerine yogunlaşmıştır 11.

    Bu çalışmada degişik yaş gruplarından alınan karın cildi örneklerinin, AgNOR boyama yöntemi ile gösterilen hücre proliferasyonuna göre yaş tespitinde kullanılabilirliginin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    1999-2002 tarihleri arasında çeşitli nedenlerden dolayı farklı yaş grubunda exs olan 23 E, 15 K toplam 38 olgu çalışmaya alındı. Olguların geçmişinde herhangi bir tümoral hastalık hikayesi taşımadıgı yakınlarından ögrenildi. Yenidogan (0-12 ay) 4 (2E, 2K) olgu, infantil dönem (1-5 yaş) 11 (4E, 7K) olgu, adult dönem (25-35 yaş) 16 (13E, 3K) olgu ve yaşlı (50 yaş ve üzeri) 7 olgu (4E, 3K) olarak dört ayrı yaş grubu oluşturuldu.

    AgNOR boyama yöntemi :
    Olgulardan 1x1 cm ebadında abdominal cilt örnekleri alındı. Formaldehid (%10’luk) içinde fikse edildi. Toz jelatin, formik asit ve gümüş nitrat %70’lik alkol fiksasyonunda hazırlanmış parafin bloklardan 4 mikron kalınlıgında kesitler alındı. Kesitler etüv ve ksilende deparafinize edilip, sırasıyla alkol ve deiyonize sudan geçirilerek rehidrate edildi 12.

    Solüsyonlar:
    100 ml deiyonize suya 1 gr/dl olacak şekilde formik asit eklendi. Bu karışım içine 2 gr jelatin katıldı. Hafif ısıtılarak, tamamen çözünmesi saglanıp, sogumaya bırakıldı. 50 gr/dl olacak şekilde gümüş nitrat, deiyonize su ile karıştırıldı. AgNOR solüsyonu yukarıda tanımlanan %2 toz jelatin içeren formik asit solüsyonundan 1 volüm, gümüş nitratlı solüsyondan 2 volüm, boyama sırasında karıştırılarak elde edildi. Uygun hacimlerde homojenize edilerek elde edilen solüsyonun, oda ısısında, karanlık ortamda, 35 dakika süre ile, önceden elde edilen preperatlar üzerindeki doku örneklerine damlatılarak uygulanması ile AgNOR boyama yöntemi gerçekleştirildi 12.

    Sonuç:
    Cilt epidermisi çok katlı yassı epiteli malpigi tabakasındaki hücre nükleusları içinde yer alan NOR bölgeleri, siyah-kahverengi, diger tüm alanlarda zemin açık sarı renkte izlendi.

    Sayma işlemi:
    Tüm olgularda x100 immersiyon objektifinde, her nükleus için nükleolar membran ve granüler nükleolar matriksin net seçildigi ayar saptanarak, rastgele 100 hücre Howat’ın önerdigi şekilde sayıldı 12. AgNOR sayımı yapıldıktan sonra, her olgunun ortalama AgNOR skoru ve standart sapması belirlendi. Istatiksel olarak yaş grubları arasında karşılaştırma yapıldı. Ayrıca cinsiyet ayırımına baglı anlamlı bir fark olup olmadıgı incelendi.

    Verilerin istatistiksel karşılaştırmaları “SPSS 5.0 for windows” paket programı kullanılarak tespit edildi. Istatistiksel testler olarak da ki-kare ve Pearson korelasyonu kullanıldı.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    Çalışmaya alınan tüm örnekler farklı yaş gruplarına göre ayrıldı. Tüm olgularda nükleus içndeki NOR benekleri, rastgele 100 hücre Howat’ın önerdigi şekilde sayıldı. Bu sayım sırasında benekçikler şekil ve boyut farklılıgı açısından da degerlendirildi. Yaş gruplarına göre tespit edilen ortalama AgNOR dagılım skoru belirlendi ve her yaş grubu için istatistiksel olarak anlamlı kabul edilebilir en düşük ve en yüksek sayısal degerler verildi. Yaş ortalaması arttıkça AgNOR boyama yöntemiyle azalan sayıda NOR benekleri boyanması tespit edildi (Şekil 1, 2, 3, 4).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: Yenidoğan (0-12 ay) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (sayıca fazla ve iri görünümlü)


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: İnfant (1-5) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (sayıca fazla ve küçük görünümlü)


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 3: Adult (25-35) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (tek tek ve iri görünümlü)


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 4: Yaşlı (50 yaş ve üzeri) Yaş Grubuna Bağlı NOR Benekleri (tek tek ve küçük görünümlü)

    Yenidogan (0-12 ay) yaş grubunda NOR benekleri boyaması ortalama 2.15 olarak en yüksek oranda AgNOR dagılımı gösterdi. Bunu infant 1.89, adult 1.67 ve yaşlı yaş grubu 1.46 olmak üzere azalan ortalama degerleri ile izledi (Tablo 1).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: Yaş Grubuna Bağlı AgNOR Ortalaması ve Değer Aralığı

    Sonuç olarak tüm yaş gruplarında ortalama proliferatif indeks incelendiginde, en genç yaş grubundan en büyük yaş grubuna dogru azalan oranda AgNOR dagılımları skoru ile yaş grupları arasında anlamlı bir ilişki vardı (p<0.01). Bireylerin genç yaşlarda gelişme süreci içinde, hücrelerin hızlı proliferasyonu nedeni ile hücre bölünmesine katkıda bulunan NOR bölgelerinin arttıgı, yaşlı popülasyonda ise hücre bölünme sayı ve yeteneginin azalması ile NOR bölgelerinin azaldıgı tespit edilmiştir. Bu durum yaş tespitinin histolojik tanısında, önemli bir belirleyici olarak olarak degerlendirildi. Böylece AgNOR yöntemiyle postmortem insan epidermisinde yaşla dogru orantılı degişiklikler açıkça gösterildi. Ki-kare testi uygulandıgında her grup içinde ve genel ortalamaya bakıldıgında cinsiyet ayırımına baglı anlamlı bir fark saptanmadı.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Geçmişten günümüze kadar yapılan çeşitli çalışmalar ve morfolojik araştırmalar yaş tespitinde en dogru yaklaşımı bulmak için yapılmaktadır 13,14. Epifiz, kemikleşme merkezleri ve kraniyal süturların kapanması, simfisiz pubisteki degişiklikler, kostaların kalsifikasyon gösteren sternal birleşme noktaları ve çeşitli biyokimyasal çalışmalar yaş tesbitinde tanımlayıcı tetkikler olarak uygulanmaktadır 13-19. Bu çalışmada AgNOR yöntemi, kronolojik yaş tespitinde istisnai bir araştırma olarak yapılmıştır. Özellikle adli amaçlı yapılan çalışmalarda bu yöntem bireylerin yaş tespitinde alternatif bir metot olarak sunulmuştur. Böylece, rutinde kullanılan diger metotlarda yaşanan bazı güçlükler ve net olamayan veriler bu yöntem ile aşılmaya çalışılmıştır. Farklı yaş gruplarına ait 38 insan cildinden alınan örnekler AgNOR boyama yöntemi kullanılarak degerlendirilmiş ve sonuçları bu çalışmada sunulmuştur.

    Tüm yaş grupları degerlendirildiginde yeni dogan (0-12 ay) yaş grubunun sayısal AgNOR dagılım skoru % 10.5 olarak tespit edildi. Bu deger, diger yaş grupları ile kıyaslandıgında anlamlı degerlendirilebilecek ölçüde yüksekti. Ki-Kare ve Korelasyon degerleri istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.01). Böylelikle, yaşa baglı degişikliklerin AgNOR boyama yöntemi ile tespit edilebilecegi görüldü. Bu çalışma ile, adli uygulamalarda karşılaşılan yaş tespiti vakalarında histokimyasal tanı yöntemi olarak AgNOR’un önemli bir alternatif yöntem olarak kullanılabilecegi gösterildi.

    Butler ve arkadaşları 5, yaş ve cinsiyet arasında farklılık ve yaş ile AgNOR arasında negatif korelasyon olup olmadıgını bulmak için AgNOR’u kromozomlarda kullanmışlar; ancak bulunan bu korelasyon istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmemiştir. Yaptıgımız bu çalışmada ise, yaş ve AgNOR arasında anlamlı bir istatiksel karşılaştırma elde edilmiştir. Das, lenfositlerle yaptıgı çalışmada özellikle yenidogan kord kanından elde ettigi lenfositlerin AgNOR boyaması neticesinde tespit edilen NOR beneklerinin 9.49 oranı ile diger yaş gruplarına göre en yüksek sayısal ortalamayı verdigini göstermiştir 6. Bizim çalışmamızda da bu çalışmada elde edilen sonuçlarla uyumlu olarak benzer şekilde en genç yaş grubunu oluşturan yenidogan (0-12 ay) grubundan, en büyük yaş grubunu oluşturan yaşlı (50 yaş ve üzeri) grubuna dogru azalan oranda AgNOR dagılımı sayısal ortalaması tespit edilmiştir.

    AgNOR boyama yöntemi kullanılarak yapılan birçok çalışmada kan ve kan ürünleri kullanılmıştır 3-6. Bizim çalışmamızda kan örnegi elde edilemeyen, hatta bireyin kendisinin de olmadıgı durumlarda elde edilen veya delil olarak ele geçen deri gibi küçük doku parçalarına dahi yöntemin uygulanarak, yaş grubu hakkında yorum yapılabilmesi pratik uygulama için önemli bir avantaj ve gelişme olarak degerlendirilmiştir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Sonuç
    Bilindigi gibi adli uygulamalarda postmortem olguların ve özellikle kimlik tespiti yapılamayan bireylerin yaşlarının tespiti, araştırmalarla sınanmış ve etkinligi gösterilmiş yöntemlerin rutin kullanıma giremeyişi nedeniyle hala sorun olarak devam etmektedir. Kimlik tespiti yapılamayan postmortem olguların karın cildi örneklerinden AgNOR boyama yöntemi ile yaş tespiti kullanışlı bir metottur. Bu metot yaşayan olguların cilt biyopsilerine de kolaylıkla uygulanabilmektedir. Karın cildinin çok esnek olması sebebiyle, bu bölgeden alınan örnekler probleme sebep olmamaktadır. Oldukça güvenilir sonuçlar elde edilen bu metotun rutinde kullanılan diger yöntemlerle karşılaştırıldıgında gerekli ve yeterli ölçüde uygun ve kabul edilebilir bir yöntem olduguna dair veriler elde edilmiştir.

    Insan derisinde AgNOR boyama yönteminin uygulanması, bireylerin yaş tespitinde kullanışlı bir araç ve alternatif bir metot niteliginde olabilecegi sonucuna varılmıştır. Özellikle küçük dokularda kullanılabilirligi nedeni ile geliştirmek ve yaygınlaştırmak üzere bir ön çalışma niteligindedir. Bu sonuçlar adli patolojide potansiyel uygulanabilirliginden dolayı ilgi çekicidir. Ancak insan yaşının belirlenmesinde daha iyi sonuçlar elde edilebilmesi için daha çok birey üzerinde ileri araştırmalar yapılmalıdır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Aykaç M. Adli Tıp Ders Kitabı. Istanbul Üniversitesi Tıp Fak. Yayınlarından, Rektörlük no.3483, Fakülte no.170 Istanbul. 1987: 268-270.

    2) Walker RA. The histopathological evaluation of nücleolar organizer region proteins. Histopathology 1988; 12: 221-223.

    3) Fakan S, Verdun DH. The nucleolus and the nucleolar organizer regions. Biol Cell 1986; 56: 189-206.

    4) Egan MJ, Raafat F, Crocker J, Smith K. Nucleolar organizer regions in small cell tumours of childhood. J Pathol 1987; 187: 275-280.

    5) Butler MG, Lane JR. Effects of age, sex, and multiple endocrine neoplazia type-II on silver stained nucleolar organizer region. Mech Ageing Dev 1989; 47: 17-24.

    6) Das BC, Rani R, Mıtra AB, Luthra US. The number of silver staining NORs (rDNA) in lymphocytes of newborns and its relatıonshıp to human development. Mech Ageing Dev 1986; 36: 117-123.

    7) Courvalin JC. A protein of Mr. 80000 is associated with the nucleolus organizer of human cell lines. Chromosoma 1986; 94: 353-361.

    8) Hirai H. Paragonimus ohirai: Identification of nucleolar organizer regions (NORs) and silver nitrare staining pattern in spermatogenesis. Exp Parasitol 1988; 67: 281-286.

    9) Hansen AB, Ostegard B. Nucleolar organiser regions in hyperplastic and neoplastic prostatic tissue. Wirch Arch A Pathol Anat 1990; 417: 9-13

    10) Stout SD. The use of histomorphology to estimate age. J Forensic Sci 1998; 33: 121-125.

    11) Kirkeby S, Garbarsch C. Histochemical studies of the masseter, the temporal and small zygomaticomandibular, and the temporomandibular masticatory muscles from aged male and female humans. Fiber types and myosin isoforms. Cranio 2001; 19: 174-182.

    12) 12.Crocker J, Boldy DA, Egan MJ. How should we count AgNORS ? Proposals for a standardised approach. J Pathol 1989; 158: 185-188.

    13) Oettle AC, Steyn M. Age estimation from sternal ends of ribs by phase analysis in South African blacks. J Forensic Sci 2000; 45:1071-1079.

    14) Martin-de las Heras SM, Valenzuela A, Overall CM. Gelatinize A in human dentin as a new biochemical marker for age estimation. J Forensic Sci 2000; 45: 807-811.

    15) Yoder C, Ubelaker DH, Powell JF. Examination of variation in sternal rib end morphology relevant to age assessment. J Forensic Sci 2001; 46: 223-227.

    16) Sato Y, Kondo T, Ohshima T. Estimation of age of human cadavers by immunohistochemical assessment of advanced glycation end products in the hippocampus. Histopathology 2001; 38: 217-220.

    17) Galera V, Ubelaker DH, Hayek LAC. Comparison of macroscopic cranial methods of age estimation applied to skeletons from the Terry collection. J Forensic Sci 1998; 43: 933- 939.

    18) Barchilon V, Hershkovitz I, Rothschild BM et al. Factors affecting the rate and pattern of the first costal cartilage ossification. Am J Foren Med Path 1996; 17: 239-247.

    19) Ohtani S, Yamada Y, Yamamoto I. Improvement of age estimation using amino acid racemization in a case of pink teeth. Am J Foren Med Path 1998; 19: 77-79.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
    [ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]